一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶及其制備方法與流程

本發明涉及固定化酶技術領域，具體涉及一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶及其制備方法。

背景技術：

固定化酶(immobilized enzyme)是通過物理的或化學的方法，將酶束縛于水不溶性載體上或一定的空間內，從而達到限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發揮催化作用的技術，反應結束后并能使酶與底物、產物分開，酶能夠重復使用。固定化酶的制備方法可分為以下幾種：吸附、共價結合、包埋和交聯。共價結合方式是將酶與載體通過共價鍵連接起來。為了達到有效的共價連接，必須預先活化載體或酶上的有關官能團。與其它非共價、吸附作用的固定化方法相比，共價結合能給酶與載體之間提供最強的結合力，酶與載體的連接很牢，使用過程中酶漏出量最少，穩定性良好。

然而綜合現有共價結合固定化酶的技術，發現這些方法存在以下一些弊端：(1)、載體的活化及固定化操作復雜，過程繁瑣；(2)、載體的活化及固定化反應條件較劇烈，極易影響載體和酶的活性；(3)、載體的親水性不佳，不利于獲得較高活力的固定化酶。

技術實現要素：

為解決上述問題，本發明提供了一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶及其制備方法。本發明固定化酶的制備方法工藝簡單，反應條件溫和，制得的固定化酶采用親水性強的聚乙烯醇微納米泡作為載體，有利于獲得較高活力的固定化酶。

本發明第一方面提供了一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶，包括聚乙烯醇微納米泡和酶，所述聚乙烯醇微納米泡和所述酶通過酰胺鍵進行共價結合。

優選地，所述聚乙烯醇微納米泡的粒徑為200nm-3μm。

所述酶為含有氨基基團的酶。

優選地，所述酶為淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、乳糖酶或蛋白酶。

本發明第一方面提供的一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶，聚乙烯醇微納米泡親水性較強，有利于獲得較高活力的固定化酶。

本發明第二方面提供了一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)、提供聚乙烯醇微納米泡，將所述聚乙烯醇微納米泡置于羰基二氮唑溶液中，室溫下攪拌反應12-36小時，過濾、純化后，得到活化后的聚乙烯醇微納米泡；所述羰基二氮唑和所述聚乙烯醇微納米泡的質量比為1:10-1:25；

(2)、將所述活化后的聚乙烯醇微納米泡置于酶溶液中，在2℃-8℃條件下攪拌反應18-24小時，洗滌后，真空干燥，得到以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶，所述活化后的聚乙烯醇微納米泡和所述酶的質量比為5:1-20:1，所述以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶包括聚乙烯醇微納米泡載體和酶，所述聚乙烯醇微納米泡和所述酶通過酰胺鍵進行共價結合。

優選地，所述聚乙烯醇微納米泡的粒徑為200nm-3μm。

優選地，所述聚乙烯醇微納米泡制備方法如下：

(1)將聚乙烯醇溶解在溶劑中得到聚乙烯醇水溶液，隨后在所述聚乙烯醇水溶液中加入氧化劑充分加熱攪拌，所述聚乙烯醇主鏈中兩個乙烯醇單元相連接形成的鄰二羥基結構被氧化成醛基后斷鏈，制得含有聚乙烯醇斷鏈產物的水溶液，所述氧化劑選自高碘酸鈉、偏高碘酸鉀、偏高碘酸鈉和四醋酸鉛中的至少一種；

(2)向所述含有聚乙烯醇斷鏈產物的水溶液中加酸調節pH值至1～4，得到混合溶液，攪拌，所述混合溶液中的所述聚乙烯醇斷鏈產物之間發生交聯反應形 成微納米泡膜，所述微納米泡膜內包含空氣形成聚乙烯醇微納米泡。

優選地，所述酶為淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、乳糖酶或蛋白酶。

優選地，所述羰基二氮唑溶液中的溶劑為丙酮、乙醇或1,4-二氧六環。

優選地，所述酶溶液中的溶劑為蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。

優選地，步驟(2)中的所述洗滌的方法為：反應結束后，將聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶分別使用0.5M氯化鈉溶液洗滌2至3次和0.5M醋酸溶液洗滌2至3次。

本發明第二方面提供的一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，活化和固定化條件溫和，工藝簡單，所制得的以親水性聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶親水性好，酶活力較高。

綜上，本發明有益效果包括以下幾個方面：

1、本發明提供的固定化酶的制備方法中，活化和固定化反應條件溫和、操作簡單，降低了活化和固定化過程中對載體和酶活力的損失，十分適用于固定化酶的工業化生產；

2、本發明以聚乙烯醇微納米泡為載體，聚乙烯醇微納米泡中富含羥基，親水性較好，利于獲得較高活力的固定化酶。

附圖說明

圖1為本發明實施例聚乙烯醇微納米泡的掃描電鏡(SEM)圖；

圖2為本發明實施例聚乙烯醇微納米泡的透射電鏡(TEM)圖；

圖3為本發明實施例以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備流程圖。

具體實施方式

以下所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。

本發明第一方面提供了一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶，包括聚 乙烯醇微納米泡和酶，聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。

聚乙烯醇微納米泡指粒徑為微米或納米尺寸的聚乙烯醇微納米泡。可通過合適工藝獲得不同形態、尺寸的親水性聚乙烯醇微納米泡。

優選地，聚乙烯醇微納米泡的粒徑為200nm-3μm。

優選地，聚乙烯醇微納米泡采用公開號為CN103724638A提供的制備方法進行制備。

優選地，所述聚乙烯醇微納米泡制備方法如下：

(1)將聚乙烯醇溶解在溶劑中得到聚乙烯醇水溶液，隨后在所述聚乙烯醇水溶液中加入氧化劑充分加熱攪拌，所述聚乙烯醇主鏈中兩個乙烯醇單元相連接形成的鄰二羥基結構被氧化成醛基后斷鏈，制得含有聚乙烯醇斷鏈產物的水溶液，所述氧化劑選自高碘酸鈉、偏高碘酸鉀、偏高碘酸鈉和四醋酸鉛中的至少一種；

(2)向所述含有聚乙烯醇斷鏈產物的水溶液中加酸調節pH值至1～4，得到混合溶液，攪拌，所述混合溶液中的所述聚乙烯醇斷鏈產物之間發生交聯反應形成微納米泡膜，所述微納米泡膜內包含空氣形成聚乙烯醇微納米泡。

要獲得理想的固定化酶，載體的作用十分關鍵。載體有效面積決定了載體結合固定化酶的最大負載量，載體的親水性影響固定化酶的活性。聚乙烯醇(Poly(vinyl alcohol),PVA)是一種性能非常優異的高分子材料，采用簡單溫和的工藝進一步制成粒徑在200nm-3μm可控的PVA微納米泡，然后以PVA微納米泡作為固定化酶載體，原料方便易得，載體親水性十分良好，比表面積大，且載體表面富含活性羥基，一方面對獲得酶保留活性好、催化活性佳的固定化酶十分有利，另一方面也十分便于催化反應過后酶與小分子反應物通過分離膜與產物的分離，對獲得高酶負載量和提高酶蛋白結合位點密度十分有利。

酶為含有氨基基團的酶。

優選地，酶為淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、乳糖酶或蛋白酶。

聚乙烯醇微納米泡載體與酶通過穩定的酰胺鍵進行共價結合，這一結合方式對得到穩定好的固定化酶十分有利，便于酶的回收和再利用。

本發明第一方面提供的一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶，以聚乙烯醇微納米泡為載體，聚乙烯醇微納米泡親水性較強，材料表面富含羥基，表面積大，一方面對獲得酶保留活性好、催化活性佳的固定化酶十分有利，另一方面也十分便于催化反應過后酶與小分子反應物與產物的分離；有利于獲得較高活力的固定化酶。

本發明第二方面提供了一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)、提供聚乙烯醇微納米泡，將聚乙烯醇微納米泡置于羰基二氮唑溶液中，室溫下攪拌反應12-36小時，過濾、純化后，得到活化后的聚乙烯醇微納米泡；羰基二氮唑和聚乙烯醇微納米泡的質量比為1:10-1:25；

(2)、將活化后的聚乙烯醇微納米泡置于酶溶液中，在2℃-8℃條件下攪拌反應18-24小時，洗滌后，真空干燥，得到以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶，活化后的聚乙烯醇微納米泡和酶的質量比為5:1-20:1，聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶包括聚乙烯醇微納米泡載體和酶，聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。

通過合適工藝獲得不同形態、尺寸的親水性聚乙烯醇微納米泡作為載體，聚乙烯醇微納米泡的粒徑為微米或納米尺寸。

優選地，聚乙烯醇微納米泡的粒徑為200nm-3μm。

優選地，聚乙烯醇微納米泡可采用公開號為CN103724638A提供的制備方法進行制備。

優選地，聚乙烯醇微納米泡制備方法如下：

(1)將聚乙烯醇溶解在溶劑中得到聚乙烯醇水溶液，隨后在所述聚乙烯醇水溶液中加入氧化劑充分加熱攪拌，所述聚乙烯醇主鏈中兩個乙烯醇單元相連接形成的鄰二羥基結構被氧化成醛基后斷鏈，制得含有聚乙烯醇斷鏈產物的水溶液，所述氧化劑選自高碘酸鈉、偏高碘酸鉀、偏高碘酸鈉和四醋酸鉛中的至少一種；

(2)向所述含有聚乙烯醇斷鏈產物的水溶液中加酸調節pH值至1～4，得到 混合溶液，攪拌，所述混合溶液中的所述聚乙烯醇斷鏈產物之間發生交聯反應形成微納米泡膜，所述微納米泡膜內包含空氣形成聚乙烯醇微納米泡。

優選地，羰基二氮唑溶液中的溶劑為丙酮、乙醇或1,4-二氧六環。

優選地，步驟(1)過濾、純化的方法為：反應結束后，過濾，然后將活化后的聚乙烯醇微納米泡使用丙酮洗滌2到3次，真空干燥，4℃下儲存備用。

優選地，步驟(2)中，將活化后的聚乙烯醇微納米泡首先加入到50mM,pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，然后再加入酶溶液，進行反應。

優選地，酶溶液中的溶劑為蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。

優選地，酶溶液的濃度為1-30mg/ml。

優選地，步驟(2)中的洗滌的方法為：反應結束后，將聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶分別使用0.5M氯化鈉溶液洗滌2至3次和0.5M醋酸溶液洗滌2至3次。

以羰基二氮唑(又稱N'N-羰基二咪唑，簡稱CDI，化學式為)為活化劑，在溫和的條件下，對富含羥基的聚乙烯醇微納米泡進行活化，聚乙烯醇微納米泡的羥基和CDI發生反應形成酯基咪唑結構，得到活化后的聚乙烯醇微納米泡，然后將活化后的聚乙烯醇微納米泡和酶進行反應，酶蛋白由于賴氨酸殘基上含伯氨基，作為親核試劑進攻活化后的載體，形成-O-(C＝O)-NH-的結合方式，使聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合，形成的固定化酶的穩定性較好，便于酶的回收和再利用。本發明活化條件和固定化條件溫和，制備方法簡單，有利于固定化酶的產業化生產。

本發明第二方面提供的一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，活化和固定化條件溫和，工藝簡單，所制得的以親水性聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶具有載體比表面積大，親水性好，酶活收率高、穩定性好的優點。

本發明旨在提供一種采用形狀與尺寸可控的親水性聚乙烯醇微納米泡作為 載體的新型固定化酶及其制備方法，首先，通過合適工藝獲得不同形態、尺寸的親水性聚乙烯醇微納米泡作為載體，然后，室溫下采用十分溫和的氧化劑一步得到活化后的載體，進一步在溫和條件下采用活化后的載體與活性酶蛋白進行處理，使其互相進行共價結合，制得一種以形狀與尺寸可控的親水性聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶。所制得的以親水性聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶具有載體比表面積大，親水性好，酶活收率高、穩定性好的優點，所采用的制備工藝、載體活化及固定化操作簡單，反應條件溫和。

圖1為本發明采用的一種PVA微納米泡的SEM圖。圖2為本發明采用的一種PVA微納米泡的TEM圖，從圖1和圖2中可以看出，聚乙烯醇微納米泡的粒徑為200nm-3μm，粒徑可控。

圖3為本發明實施例以聚乙烯醇微納米泡載體的固定化酶的制備流程圖，PVA微納米泡1在活化劑CDI的作用下，得到活化后的PVA微納米泡2，將PVA微納米泡2和酶3進行反應得到以聚乙烯醇微納米泡微載體的固定化酶4。以聚乙烯醇微納米泡微載體的固定化酶4包括聚乙烯醇微納米泡和酶，聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。可以調整活化劑CDI和聚乙烯醇微納米泡的質量比控制聚乙烯醇微納米泡的活化程度，進一步控制酶在載體上的負載量，最終控制固定化酶的催化活性。

實施例1：

一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)取40mg羰基二氮唑溶于10ml丙酮中，加入1g聚乙烯醇微納米泡，室溫下攪拌12小時，過濾，丙酮充分洗滌，真空干燥，4℃下儲存備用，制得活化后的聚乙烯醇微納米泡；

(2)將上述活化后的聚乙烯醇微納米泡加入到50ml 50mM,PH＝7的磷酸鹽緩沖液中，然后加入20ml 10mg/ml的脂肪酶溶液，2℃下攪拌18小時，分別用0.5M氯化鈉溶液洗滌3次，0.5M醋酸溶液洗滌3次，真空干燥后，得到以聚乙烯醇微納 米泡為載體的固定化脂肪酶1.108g。聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。

測試上述制得的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶的活力：以4ml橄欖油乳化液為底物，加5ml,0.25M,pH＝7.5的PBS緩沖液，在40℃下保溫5分鐘，加入0.02g上述以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶，精確計時保溫30min，最后加15ml,95％乙醇，終止酶反應。加3滴酚酞用0.05mol/LNaOH滴定產生的酸，消耗氫氧化鈉溶液14.9ml，我們定義在40℃，pH＝7.5，每分鐘水解釋放出1μmol游離有機酸所需的脂肪酶的量為一個活力單位，活力計算方法如下：固定化酶的活力：U(u/mg)＝V(氫氧化鈉溶液體積)×N(氫氧化鈉溶液濃度)×10³/t(反應時間)＝4.97×10^-5。由此可知，本發明實施例1制得的固定化酶的活力較高。

實施例2：

一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)取60mg羰基二氮唑溶于10ml丙酮中，加入1g聚乙烯醇微納米泡，室溫下攪拌36小時，過濾，丙酮充分洗滌，真空干燥，4℃下儲存備用，制得活化后的聚乙烯醇微納米泡；

(2)將上述活化后的聚乙烯醇微納米泡加入到50ml 50mM,pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，然后加入15ml 10mg/ml的脂肪酶溶液，8℃下攪拌20小時，分別用0.5M氯化鈉溶液洗滌3次，0.5M醋酸溶液洗滌3次，真空干燥后，得到以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶1.126g。聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。

測試上述制得的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶的活力：以4ml橄欖油乳化液為底物，加5ml,0.25M,pH＝7.5的PBS緩沖液，在40℃下保溫5分鐘，加入0.02g上述以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶，精確計時保溫30min，最后加15ml,95％乙醇，終止酶反應。加3滴酚酞用0.05mol/LNaOH滴定產生的酸，消耗氫氧化鈉溶液16.7ml，我們定義在40℃，pH＝7.5，每分鐘水解釋放出1μmol游離有機酸所需的脂肪酶的量為一個活力單位，活力計算方法如下：固定化酶的 活力：U(u/mg)＝V(氫氧化鈉溶液體積)×N(氫氧化鈉溶液濃度)×10³/t(反應時間)＝5.57×10^-5。由此可知，本發明實施例2制得的固定化酶的活力較高。

實施例3：

一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)取80mg羰基二氮唑溶于10ml丙酮中，加入1g聚乙烯醇微納米泡，室溫下攪拌24小時，過濾，丙酮充分洗滌，真空干燥，4℃下儲存備用，制得活化后的聚乙烯醇微納米泡；

(2)將上述活化后的聚乙烯醇微納米泡加入到50ml 50mM,PH＝7的磷酸鹽緩沖液中，加入5ml 10mg/ml的脂肪酶溶液，4℃下攪拌24小時，分別用0.5M氯化鈉溶液洗滌3次，0.5M醋酸溶液洗滌3次，真空干燥后，得到以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶1.104g。聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。

測試上述制得的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶的活力：以4ml橄欖油乳化液為底物，加5ml,0.25M,pH＝7.5的PBS緩沖液，在40℃下保溫5分鐘，加入0.02g上述以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化脂肪酶，精確計時保溫30min，最后加15ml,95％乙醇，終止酶反應。加3滴酚酞用0.05mol/LNaOH滴定產生的酸，消耗氫氧化鈉溶液21.8ml，我們定義在40℃，pH＝7.5，每分鐘水解釋放出1μmol游離有機酸所需的脂肪酶的量為一個活力單位，活力計算方法如下：固定化酶的活力：U(u/mg)＝V(氫氧化鈉溶液體積)×N(氫氧化鈉溶液濃度)×10³/t(反應時間)＝7.27×10^-5。由此可知，本發明實施例3制得的固定化酶的活力較高。

實施例4：

一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)取40mg羰基二氮唑溶于10ml丙酮中，加入1g聚乙烯醇微納米泡，室溫下攪拌24小時，過濾，丙酮充分洗滌，真空干燥，4℃下儲存備用，制得活化后的聚乙烯醇微納米泡；

(2)將上述活化后的聚乙烯醇微納米泡加入到50ml 50mM,pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，加入20ml 10mg/ml的1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液，4℃下攪拌24小時后，分別用0.5M氯化鈉溶液洗滌3次，0.5M醋酸溶液洗滌3次，真空干燥后，得到以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶1.124g。聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。

測試以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶的活力：將上述制得的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶加到蒸餾水中配制成濃度為2mg/ml的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液，然后取1ml 2mg/ml的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液，加入到50ml錐形瓶中，加入2ml 10mg/ml的3,5-二硝基水楊酸，同時，另取1ml 10mg/ml的淀粉溶液于10ml錐形瓶中，將上述兩個錐形瓶分別置40℃恒溫水浴中保溫10min，然后將上述兩個錐形瓶中的淀粉溶液和1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液混合后置40℃下準確保溫5min后，取少量溶液，測定淀粉在1,4-α-D-葡聚糖水解酶催化下降解產生的麥芽糖含量C為6.96mg。我們定義在40℃，pH＝5.6下，每分鐘釋放出的麥芽糖含量占淀粉總質量的百分數為一個活力單位，活力計算方法如下：U＝(/min)＝C(麥芽糖質量)/w(淀粉質量)t(反應時間)＝13.92％/min。由此可知，本發明實施例4制得的固定化酶的活力較高。

實施例5：

一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)取60mg羰基二氮唑溶于10ml丙酮中，加入1g聚乙烯醇微納米泡，室溫下攪拌24小時，過濾，丙酮充分洗滌，真空干燥，4℃下儲存備用，制得活化后的聚乙烯醇微納米泡；

(2)將上述活化后的聚乙烯醇微納米泡加入到50ml 50mM,pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，加入15ml 10mg/ml的1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液，4℃下攪拌24小時后，分別用0.5M氯化鈉溶液，0.5M醋酸溶液洗滌3次，得到以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶1.119g。聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進 行共價結合。

測試以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶的活力：將上述制得的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶加到蒸餾水中配制成濃度為2mg/ml的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液，然后取1ml 2mg/ml的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶，加入到50ml錐形瓶中，加入2ml 10mg/ml的3,5-二硝基水楊酸，同時，另取1ml 10mg/ml的淀粉溶液于10ml錐形瓶中，將上述兩個錐形瓶分別置40℃恒溫水浴中保溫10min，然后將上述兩個錐形瓶中的淀粉溶液和1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液混合后置40℃下準確保溫5min后，取少量溶液，測定淀粉在1,4-α-D-葡聚糖水解酶催化下降解產生的麥芽糖含量C為7.58mg。我們定義在40℃，pH＝5.6下，每分鐘釋放出的麥芽糖含量占淀粉總質量的百分數為一個活力單位，活力計算方法如下：U＝(/min)＝C(麥芽糖質量)/w(淀粉質量)t(反應時間)＝15.16％/min。由此可知，本發明實施例5制得的固定化酶的活力較高。

實施例6：

一種以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)取80mg羰基二氮唑溶于10ml丙酮中，加入1g聚乙烯醇微納米泡，室溫下攪拌24小時，過濾，丙酮充分洗滌，真空干燥，4℃下儲存備用，制得活化后的聚乙烯醇微納米泡；

(2)將上述活化后的聚乙烯醇微納米泡加入到50ml 50mM,PH＝7的磷酸鹽緩沖液中，加入5ml 10mg/ml的1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液，4℃下攪拌24小時后，分別用0.5M氯化鈉溶液，0.5M醋酸溶液洗滌3次，得到以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶1.108g。聚乙烯醇微納米泡和酶通過酰胺鍵進行共價結合。

測試以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶的活力：將上述制得的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶加到蒸餾水中配制成濃度為2mg/ml的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡 聚糖水解酶溶液，然后取1ml 2mg/ml的以聚乙烯醇微納米泡為載體的固定化的1,4-α-D葡聚糖水解酶，加入到50ml錐形瓶中，加入2ml 10mg/ml的3,5-二硝基水楊酸，同時，另取1ml 10mg/ml的淀粉溶液于10ml錐形瓶中，將上述兩個錐形瓶分別置40℃恒溫水浴中保溫10min，然后將上述兩個錐形瓶中的淀粉溶液和1,4-α-D葡聚糖水解酶溶液混合后置40℃下準確保溫5min后，取少量溶液，測定淀粉在1,4-α-D-葡聚糖水解酶催化下降解產生的麥芽糖含量C為8.25mg。我們定義在40℃，pH＝5.6下，每分鐘釋放出的麥芽糖含量占淀粉總質量的百分數為一個活力單位，活力計算方法如下：U＝(/min)＝C(麥芽糖質量)/w(淀粉質量)t(反應時間)＝16.50％/min。由此可知，本發明實施例6制得的固定化酶的活力較高。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。