含有人SLC3A2基因的慢病毒載體及其構建方法與流程

本發明涉及DNA遺傳工程和小型豬轉基因工程領域，尤其涉及一種含有人SLC3A2基因的慢病毒載體的構建方法。

背景技術：

轉基因動物模型在了解人類疾病的發病過程中起著重要的作用，在開發新型藥物中也同樣有不容忽視的作用。經典的轉基因小鼠模型在生物醫學的研究歷程中有重要的作用。然而，小鼠和人類在包括生理特性和基因表達等許多方面是不同的。因此，小鼠模型在某些情況下不能充分模仿人類基本疾病類型，所以大型動物模型仍然是迫切需要的。在過去20年，轉基因小型豬越來越成為研究人類疾病和其他生物學應用的重要動物模型。

病毒載體是提高轉基因表達的一個有效途徑。慢病毒可以感染分裂和非分裂細胞。并且可以將外源DNA插入到感染細胞的基因組中。慢病毒使插入的基因序列容量較大，而且這類病毒載體插入的基因能夠避免基因沉默并且能在體內穩定表達，能在整合酶基因突變喪失功能時整合，所以生物安全性較高。研究發現，慢病毒載體轉染細胞后比逆轉錄病毒的致癌性低。腺病毒載體攜帶的目的基因不會整合到宿主細胞的基因組中，且在傳代的細胞中將基因信息丟失，同時一些腺病毒基因產物也會致細胞凋亡。研究表明慢病毒載體和逆轉錄病毒一樣能在體外感染雄性小鼠生殖系細胞。另一項研究報道，采用慢病毒載體感染生殖干細胞產生的轉基因大鼠，并且穩定遺傳到了F2代。迄今為止，已經由慢病毒轉基因產生的各種轉基因動物包括小鼠、魚、豬、非人靈長類動物等。相比傳統的原核DNA顯微注射或體細胞克隆，慢病毒基因轉移的效果要高4到8倍，并且在90％以上的第一代轉基因動物上都能檢測到轉基因表達。因此，開發一個可用于轉基因小型豬開發的新載體及其構建方法將是解決生產實踐中育種時間長的有效方法。

溶質轉運蛋白(SLC)基因家族中的SLC3A2、SLC7A1、SLC12A8、SLC22A16、SLC22A 1、SLC22A 2、SLC22A 3基因及其編碼的蛋白質可參與多胺的跨膜物質轉運。SLC3A2和GGTL3B可與細胞內CT120A相互作用，可能擁有與氨基酸轉運及谷胱苷肽代謝有關的重要的生理功能。CT120是在染色體17p13.3高頻突變區通過電子克隆及RACE方法克隆并鑒定出的一個人新基因，是一個與乳腺癌及肺癌等發生發展相關的細胞生長重要調節因子。

技術實現要素：

本發明的目的是一種含有SLC3A2基因的慢病毒載體及其構建方法，以解決針對目的基因生長功能的實踐驗證和轉基因小型豬開發新方法的問題。

本發明的第一個方面提供一種含有SLC3A2基因的慢病毒載體，其中SLC3A2基因如 序列表中序列1所示，該基因編碼的氨基酸序列如序列2所示。

本發明的另一個方面提供含有SLC3A2基因的慢病毒載體的構建方法，包括以下步驟：

(A)用PCR方法擴增SLC3A2基因；

(B)將目的基因SLC3A2克隆到慢病毒載體中；

(C)制備感受態細胞；

(D)將步驟(B)制備的慢病毒載體轉化感受態細胞；

(E)從平板上挑取克隆菌落，小抽質粒并做鑒定挑出陽性克隆；

(F)純化提取的質粒，將抽提好的質粒進行雙酶切鑒定。

上述構建方法的詳細操作過程如下：

PCR方法擴增SLC3A2基因：oligo設計，目的基因SLC3A2序列片段根據編號NM_001012662.2設計，上下游引物分別加上NotI和BamHII及保護堿基，用于載體的亞克隆。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。將oligo溶解成50μM，將oligo分別取相同體積至一1.5ml離心管，混合均勻，配成oligo mix。用配制好的oligo mix進行第一輪PCR反應，用Y164-1和Y164-62進行第二輪PCR反應，模板為第一輪PCR反應的產物。第一輪PCR可得到混有目的基因的非單一條帶的PCR產物混合物，然后再用第一輪的PCR產物為模板，通過第二輪PCR則可獲得單一的目的基因條帶。PCR反應完成后，利用電泳并切膠回收SLC3A2基因片段。

目的基因SLC3A2克隆到載體LV5中：用NotI和BamHI對SLC3A2基因片段進行酶切，37℃酶切2小時；用NotI和BamHI對載體LV5進行酶切，37℃酶切2小時；電泳后，用NA凝膠回收試劑盒回收SLC3A2基因片段和載體LV5；用T4 DNA ligase連接雙酶切得到的SLC3A2基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時。

制備感受態細胞：從-70℃冰箱保存的細菌接種到固體培養基LB中，然后在37℃培養箱培養20h；在平板上挑取一個單菌落直徑約2mm，再接種到一個1L燒瓶其中含有100mlLB培養基，接著在37℃劇烈振蕩培養3h；將細菌轉移到一個無菌，用冰預冷的1.5ml EP管中，冰上放置10min后，使培養基冷卻到0℃。同時用另一管作轉化的陰性對照；然后在4℃，13000rpm，30s條件下離心；將培養液，管反轉1min，盡量使管培養液倒干凈；添加前的0.1mol/L cach500μL冷卻，在冰上5min重懸沉淀；再次在4℃，13000rpm，30s條件下離心；接著倒出培養液，最后的培養液通過把EP管倒置將其流盡；加200μl提前冰預冷0.1mol/LCach，重懸沉淀后置于冰上30min；所得產物可用于轉化。

將連接產物轉化感受態細胞：從-70℃冰箱中取出感受態細胞，將裝有其離心管冰上放置4min，待細胞解凍后，加入10μl連接產物，輕柔混勻內容物，在冰中放置30min；將離心 管放到42℃的水浴鍋中放好的試管架上，在90s后，取出離心管；快速將離心管轉移到冰浴中，使細胞冷卻3min；向每支離心管加入800μl不含抗生素的LB培養基，然后將離心管轉移到37℃搖床，250轉/分鐘，培育45min使細菌復蘇；取200μl培育后的細胞均勻涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin)；等平板上液體消失后，將平板倒置放置于37℃培養箱中，培養16h。

從平板上挑取克隆菌落，小抽質粒并做鑒定挑出陽性克隆：從培養好的平板上挑取4個單獨、飽滿的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Kanamycin)LB培養基的試管中；將上述試管置于細菌搖床中培養，37℃，250轉/分鐘，培養16小時；將培養好的菌液，用質粒小提試劑盒。

純化提取的質粒：進行瓊脂糖膠/溴化乙錠電泳分析PCR產物；確定PCR產物反應的量，將樣品轉至干凈的EP管，加4倍體積的Buffer CP；渦旋，使之徹底混勻，收集完全后，可短暫離心；將DNA結合柱放入已準備好的2ml的收集管；將上述樣品放在DNA結合柱中，在室溫條件下，離心10000g，1min；棄液體，再將DNA結合柱放到同樣的收集管中；加700μl稀釋過的DNA Wash Buffer混勻，在室溫條件下，10000g，離心1min；棄液體，重復(7)；棄去液體，將結合柱在13000g條件下離心2min；將DNA結合柱放入一個干凈的1.5ml EP管中，加30μl Elution Buffer到DNA結合柱基質使其侵沒濕潤，室溫下靜置1min，在13000g離心1min。丟棄DNA結合柱，將液體收集到1.5mlEP管中，—20℃保存；收集并鑒定。

將抽提好的質粒進行雙酶切鑒定。

酶切37℃，1小時后電泳，在目的條帶大小對應區域有酶切得到的條帶對應的克隆即為陽性克隆。

重組質粒測序驗證并大量抽提：取200μl陽性克隆對應的菌液送測序，將測序結果與目的基因序列進行比對，插入序列100％匹配，證明重組載體構建成功。

慢病毒包裝及病毒滴度檢測：感染前一天，取293T細胞傳代進入24孔板，每孔細胞接種細胞數為1*10⁵個。培養基用正常的DMEM+10％FBS即可；分別吸取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一個細胞培養孔中，不需要換細胞液。病毒可以先稀釋，再加入；2天后，丟掉細胞上清。將細胞收集下來，293T細胞基因組。以得到的基因組為模板，定量其中的內參基因BAC和病毒序列WPRE，通過相對定量的方法用2^-ΔΔCt法計算病毒基因組數和細胞基因組數的比例。每個樣品每個基因重復測兩次；引物序列和2^-ΔΔCt法；如當定量PCR的Ct值大于30，說明病毒基因組很少，數據的偏差會較大，所以這樣的數據不采用；因為使用Taqman探針，故不進行熔解曲線分析。

引物序列：人基因組特異引物和探針(BAC)，5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’ (forward primer)，5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(reverse primer)，5’-VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’(probe)，病毒基因組特異引物和探針(WPRE)，5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(forward primer)，5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(reverse primer)，5’-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3’(probe)。

附圖說明

圖1SLC3A2 PCR產物電泳圖。

M:DNA Marker；1，2，3，4：均為兩次PCR后產物。

圖2SLC3A2基因全長測序部分結果。

圖3重組載體LV5質粒圖譜。

圖4重組質粒酶切鑒定圖。

M:DNA Marker；1：LV5-SLC3A2雙酶切鑒定。

圖5LV5-SLC3A2雙酶切鑒定測序結果。

圖6慢病毒載體與精子孵育不同時間SLC3A2的表達水平。

與1h比較，**P<0.01。

M：DNA Marker；1：慢病毒載體與精子孵育1h；2慢病毒載體與精子孵育2h；3:慢病毒載體與精子孵育3h；4：慢病毒載體與精子孵育4h。

圖7免疫熒光檢測慢病毒載體與精子孵育不同時間SLC3A2的表達。

A,B：慢病毒載體與精子孵育1h；C,D:慢病毒載體與精子孵育2h；E,F:慢病毒載體與精子孵育3h；G,H：慢病毒載體與精子孵育4h。A,C,E,G在光學顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F,H在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖8不同濃度慢病毒載體與精子孵育后SLC3A2的表達水平。

與10⁴IU/ml比較，**P<0.0。

M：DNA Marker；1：0IU/ml慢病毒載體；2：10⁴IU/ml慢病毒載；3:10⁵IU/ml.慢病毒載體；4：10⁶IU/ml慢病毒載體。

圖9免疫熒光檢測不同濃度的慢病毒載體與精子孵育后SLC3A2的表達水平。

A,B：0IU/ml慢病毒載體；C,D：10⁴IU/ml慢病毒載體；E,F:10⁵IU/ml.慢病毒載體；G,H：10⁶IU/ml慢病毒載體。A,C,E,G在光學顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F,H在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖10檢測不同溫度下慢病毒載體與精子孵育SLC3A2的表達水平。

M：DNA Marker；1：17℃慢病毒載體與精子孵育；2：25℃慢病毒載體與精子孵育；3:37℃ 慢病毒載體與精子孵育。

圖11在不同溫度條件慢病毒載體與精子孵育SLC3A2的表達水平

A,B：17℃慢病毒載體與精子孵育；C,D：25℃慢病毒載體與精子孵育；3:E,F 37℃慢病毒載體與精子孵育。A,C,E在光學顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖12不同濃度Polybrene與慢病毒載體和精子共孵育SLC3A2的表達水平。

與5μg/mL polybrene比較，^**P<0.01。

圖13不同濃度Polybrene對慢病毒載體和精子共孵育的影響。

A,B：0μg/mL polybrene；C,D：5μg/mL polybrene；E,F:10μg/mL polybrene；G,H：15μg/mL polybrene。A,C,E,G在光學顯微鏡下觀測(20×)，B,D,F,H在波長為570nm的熒光顯微鏡下觀察(20×)。

圖14慢病毒載體與精子孵育不同時間對精子活力的影響。

和1h組相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

圖15不同濃度的慢病毒載體與精子孵育對精子活力的影響。

與10⁴IU/ml比較，^**P<0.01。

圖16在不同溫度下慢病毒載體與精子孵育對精子活力的影響。

與17℃組比較，^*P<0.05。

圖17不同濃度Polybrene與慢病毒載體和精子共孵育對精子細胞活力的影響。

與5μg/mL polybrene比較，^**P<0.01。

具體實施方式

PCR方法擴增SLC3A2基因：oligo設計，目的基因SLC3A2序列片段根據編號NM_001012662.2設計，上下游引物分別加上NotI和BamHII及保護堿基，用于載體的亞克隆，SLC3A2基因的堿基序列如下：

引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

將oligo溶解成50μM，將oligo分別取相同體積至一1.5ml離心管，混合均勻，配成oligo mix。

用配制好的oligo mix進行第一輪PCR反應，PCR體系如下：

反應條件

用Y164-1和Y164-62進行第二輪PCR反應，模板為第一輪PCR反應的產物。

PCR體系如下：

反應條件

第一輪PCR可得到混有目的基因的非單一條帶的PCR產物混合物，然后再用第一輪的PCR產物為模板，通過第二輪PCR則可獲得單一的目的基因條帶。條帶大小約在2000bp左右，沒有非特異性條帶產生。而目的基因片段大小為1896bp(圖1)。PCR反應完成后，利用電泳并切膠回收SLC3A2基因片段。

目的基因SLC3A2克隆到載體LV5中

用NotI和BamHI對SLC3A2基因片段進行酶切，37℃酶切2小時，酶切體系如下：

用NotI和BamHI對載體LV5進行酶切，37℃酶切2小時，酶切體系如下：

電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒回收SLC3A2基因片段和載體LV5。

用T4 DNA ligase連接雙酶切得到的SLC3A2基因片段和線性化的載體，22℃連接2小時，連接體系如下：

制備感受態細胞：從-70℃冰箱保存的細菌接種到固體培養基LB中，然后在37℃培養箱培養20h；在平板上挑取一個單菌落直徑約2mm，再接種到一個1L燒瓶其中含有100mlLB培養基，接著在37℃劇烈振蕩培養3h；將細菌轉移到一個無菌，用冰預冷的1.5ml EP管中，冰上放置10min后，使培養基冷卻到0℃。同時用另一管作轉化的陰性對照；然后在4℃，13000rpm，30s條件下離心；將培養液，管反轉1min，盡量使管培養液倒干凈；添加前的0.1mol/L cach500μL冷卻，在冰上5min重懸沉淀；再次在4℃，13000rpm，30s條件下離心；接著倒出培養液，最后的培養液通過把EP管倒置將其流盡；加200μl提前冰預冷0.1mol/LCach，重懸沉淀后置于冰上30min；所得產物可用于轉化。

將連接產物轉化感受態細胞：從-70℃冰箱中取出感受態細胞，將裝有其離心管冰上放置4min，待細胞解凍后，加入10μl連接產物，輕柔混勻內容物，在冰中放置30min；將離心管放到42℃的水浴鍋中放好的試管架上，在90s后，取出離心管；快速將離心管轉移到冰浴中，使細胞冷卻3min；向每支離心管加入800μl不含抗生素的LB培養基，然后將離心管轉移到37℃搖床，250轉/分鐘，培育45min使細菌復蘇；取200μl培育后的細胞均勻涂布于LB平板上(含50μg/ml kanamycin)；等平板上液體消失后，將平板倒置放置于37℃培養箱中，培養16h。

從平板上挑取克隆菌落，小抽質粒并做鑒定挑出陽性克隆：從培養好的平板上挑取4個 單獨、飽滿的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Kanamycin)LB培養基的試管中。將上述試管置于細菌搖床中培養，37℃，250轉/分鐘，培養16小時。將培養好的菌液，用質粒小提試劑盒：:挑取單菌落，在到含有抗生素的培養液中培養，37℃搖床培養過夜；室溫下，1000g離心1min，留4.5ml菌液，棄液體；添加250μl Solution I用微型移液槍混勻(使細胞完全懸浮)；加250μl Solution II輕輕反轉5次，不可劇烈振動，培養2min；加入350μl Solution III立即翻轉，充分混勻，直到有白色絮狀沉淀產生；在室溫，13000g的條件下離心10min，待有白色貼壁沉淀生成，馬上在14000g條件下離心15min；去上清液，吸到結合柱中，并置于2ml的收集管中，不要吸入沉淀，在室溫下離心1000g，1min；棄液體，再放置到2ml收集管中，加500μl Buffer HB，在室溫條件下離心，10000g，1min；棄液體，方知道2ml收集管中，加700μl DNA wash Buffer(稀釋)。在室溫條件下離心10000g，1min，棄液體；重復一次；離心DNA結合柱2min，13000g，甩干結合柱基質使其干燥，使殘余液體不下來；結合柱放在1.5mlEP管中，加50μl Elution Buffer即無菌去離子水到結合柱的基質上，在室溫條件下靜置1min，然后離心，13000g，1min；收集鑒定：DNA純度＝A₂₆₀×50×稀釋倍數μg/ml。

純化提取的質粒：進行瓊脂糖膠/溴化乙錠電泳分析PCR產物；確定PCR產物反應的量，將樣品轉至干凈的EP管，加4倍體積的Buffer CP；渦旋，使之徹底混勻，收集完全后，可短暫離心；將DNA結合柱放入已準備好的2ml的收集管；將上述樣品放在DNA結合柱中，在室溫條件下，離心10000g，1min；棄液體，再將DNA結合柱放到同樣的收集管中；加700μl稀釋過的DNA Wash Buffer混勻，在室溫條件下，10000g，離心1min；棄液體，重復(7)；棄去液體，將結合柱在13000g條件下離心2min；將DNA結合柱放入一個干凈的1.5ml EP管中，加30μl Elution Buffer到DNA結合柱基質使其侵沒濕潤，室溫下靜置1min，在13000g離心1min。丟棄DNA結合柱，將液體收集到1.5mlEP管中，—20℃保存；收集并鑒定：DNA純度＝A₂₆₀×50×稀釋倍數μg/ml。

將抽提好的質粒進行雙酶切鑒定，每管反應體系如下：

酶切37℃，1小時后電泳，在目的條帶大小對應區域有酶切得到的條帶對應的克隆即為陽性克隆。

重組質粒測序驗證并大量抽提：取200μl陽性克隆對應的菌液送測序，將測序結果(圖 2)與目的基因序列進行比對，插入序列100％匹配，證明重組載體構建成功(圖5)。對酶切重組載體LV5-SLC3A2鑒定：酶切37℃，1小時后電泳，在目的條帶大小對應區域有酶切得到的條帶對應的克隆即為陽性克隆。雙酶切后得到一條約為10000bp左右的條帶，和2000bp左右的條帶，且沒有其他非特異性條帶(圖4)。經過膠回收，純化產物，測序結果顯示，2000bp左右的條帶即為目的基因條帶。

慢病毒包裝及病毒滴度檢測：感染前一天，取293T細胞傳代進入24孔板，每孔細胞接種細胞數為1*10⁵個。培養基用正常的DMEM+10％FBS即可；分別吸取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一個細胞培養孔中，不需要換細胞液。病毒可以先稀釋，再加入；2天后，丟掉細胞上清。將細胞收集下來，293T細胞基因組：收集細胞在1.5mlEP管中，在室溫條件下，12000g條件下離心15min；棄去上清后，加入400μl 1M Tris-HCl，200ul EDTA，100μl 10％SDS，10μl蛋白酶K工作液，混勻后，在37℃溫育過夜；取出EP管冷卻至室溫后，充分混勻振蕩后加400μl苯酚氯仿異戊醇溶液；混勻后，在12500pm，室溫條件下，振蕩1h；取出EP管，上下顛倒混勻3min，然后在室溫條件下，10000g離心6min；小心吸取上清至另一EP管；加500μlNaCl和2倍體積無水乙醇；充分混勻后可見白色沉淀，并挑出至另一EP管；用75％乙醇洗滌2次；室溫干燥10min，直至沒有乙醇為止；加50μl無菌水溶解，放置到—20℃冰箱保存。

滴度報告：

吸取3組慢病毒上清液，經過熒光定量PCR測定，C值分別為16.24，1.21，0.21。經過計算得到慢病毒載體滴度分別為3.03×10⁸IU/ml，2.06×10⁸IU/ml，1.02×10⁸IU/ml；平均滴度為2.03×10⁸IU/ml。結果如下表所示。

表1 慢病毒載體滴度測定

以得到的基因組為模板，定量其中的內參基因BAC和病毒序列WPRE，通過相對定量的方法用2^-ΔΔCt法計算病毒基因組數和細胞基因組數的比例。每個樣品每個基因重復測兩次。

引物序列和2^-ΔΔCt法；如當定量PCR的Ct值大于30，說明病毒基因組很少，數據的偏差會較大，所以這樣的數據不采用；因為使用Taqman探針，故不進行熔解曲線分析。

2^-ΔΔCt法：假設每次擴增的效率都是一致的，那么：NC_t＝N₀*(1+E)^Ct

N₀：初始模版熒光值NC_t：經過Ct個循環擴增后的的熒光值，即閾值，我們假定它不變E：目的片斷的擴增效率

兩邊同時取對數，得：Log(NC_t)＝Ct*Log(1+E)+Log(N₀)；Ct＝-Log(N₀)*1/Log(1+E)+ Log(N C_t)/Log(1+E)。式中，Log(N Ct)/Log(1+E)為常數，Log(N₀)為自變量，Ct為應變量。以Ct對Log(N₀)作圖,-1/Log(1+E)為其斜率。設斜率為S，得：S＝-1/Log(1+E)。E＝10^-1/S–1

引物序列：

人基因組特異引物和探針(BAC)，

5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(forward primer)

5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(reverse primer)

5’-VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-TAMRA-3’(probe)

病毒基因組特異引物和探針(WPRE)：

5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(forward primer)

5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(reverse primer)

5’-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3’(probe)。

反應體系

反應條件

寧鄉花豬精子與SLC3A2慢病毒載體孵育法：收集精液5ml，添加5ml SFM/BSA后，在37℃條件下培養5min，在25℃，800g條件下離心10min，棄去上清后，在17℃，800g條件下離心10min，徹底干凈的棄去上清后，用5ml SFM/BSA將精子重懸浮，用細胞計數板將精子細胞計數，每次進行下一步實驗的精子數量約為1×10⁹個/ml。

根據不同分組條件，對精子進行孵育。

將不同濃度(10⁴IU/ml，10⁵IU/ml，10⁶IU/ml)慢病毒載體與精子細胞在17℃條件下孵育2h；將10⁵IU/ml慢病毒載體與精子細胞在17℃條件下，分別孵育不同時間(1h，2h，3h，4h)；10⁵IU/ml慢病毒載體與精子細胞分別在不同溫度(17℃，20℃，25℃，37℃)下孵育2h；不同濃度(0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL)的Polybrene分別添加10⁵IU/ml慢病毒載體和精子細胞在17℃條件下孵育2h。

用PCR檢測精子與慢病毒載體孵育后SLC3A2的表達

根據SLC3A2設計引物，引物由華大基因公司合成

將提取的DNA在如下反應體系中檢測。

反應條件如下

將得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中觀察結果。

免疫熒光法檢測精子與慢病毒載體孵育后SLC3A2的表達：提前用多聚賴氨酸處理6孔板，以備后續實驗；用1ml與慢病毒載體孵育后的精子細胞懸液放入6孔板中，用甲醇固定30min；吸去上清，用PBS洗滌3次；接著用1％BSA的PBS溶液封閉，在4℃冰箱過夜；吸取上清后，用1：1000稀釋后的VGV抗體工作液，孵育1h；去掉上清后，用PBS洗滌3次；在倒置熒光顯微鏡下觀察；用image J圖像分析軟件處理。

慢病毒載體與精子孵育不同時間SLC3A2的表達

慢病毒載體與精子孵育1h組，并沒有檢測到目的基因，而在2h組，SLC3A2的表達明顯增加。并且2h，3h，4h檢測到的目的基因水平都沒有差異。在1h，2h，3h，4h各組都能觀察到紅色熒光。而2h，3h，4h各組與1h組相比，相對熒光密度提高，有顯著性差異(P<0.01)。如圖6，7。

不同濃度慢病毒載體與精子孵育后SLC3A2的表達水平

通過PCR檢測如圖8，在0IU/ml慢病毒載體與精子孵育后，沒有目的基因條帶出現，而在與10⁴IU/ml慢病毒載體孵育后，有條帶出現；在10⁵IU/ml和10⁶IU/ml慢病毒載體與精子孵育后，目的基因水平明顯高于10⁴IU/ml時，沒有顯著差異。在熒光下觀察時如圖9，0IU/ml慢病毒載體與精子孵育后，沒有熒光。10⁴IU/ml、10⁵IU/ml和10⁶IU/ml各組，均有有紅色熒光出現；10⁶IU/ml和10⁵IU/ml組的相對熒光密度都高于10⁴IU/ml組，且有顯著性差異 (P<0.01)。

不同溫度下慢病毒載體與精子孵育SLC3A2的表達水平

分別在17℃，25℃，37℃條件下慢病毒載體與精子孵育，目的基因的水平并沒有明顯差異如圖10所示。在熒光顯微鏡觀察，慢病毒載體與精子孵育在不同溫度下，相對熒光密度也沒有明顯差異(圖11)。

不同濃度Polybrene與慢病毒載體和精子共孵育SLC3A2的表達水平

在0μg/mL和5μg/mL polybrene與慢病毒載體和精子共孵育時，目的基因的水平沒有明顯差異，與加入10μg/mL和15μg/mL polybrene相比目的基因水平低如圖12。在熒光顯微鏡下觀察時(圖13)，0μg/mL和5μg/mL polybrene組的相對熒光密度低于10μg/mL組和15μg/mL組，且有顯著性差異(P<0.01)。

檢測精子活力：吸取孵育后的精子細胞10μl到990μlSFM培養基中，混勻；在光學顯微鏡下觀察精子活力即直線運動的精子細胞數/總精子細胞數×100％

隨著慢病毒載體與精子孵育時間增加，精子活力降低：1h和2h組精子細胞活力沒有顯著性差異(P>0.05)，而3h和4h組與1h和2h組相比精子細胞活力降低，有顯著性差異(P<0.05)(圖14)。

慢病毒載體的濃度增加，精子活力降低：10⁴IU/ml、10⁵IU/ml和10⁶IU/ml各組與0IU/ml組相比，精子細胞活力降低有顯著性差異(P<0.01)。并且10⁶IU/ml組的精子細胞活力顯著低于10⁴IU/ml和10⁵IU/ml組(P<0.01)(圖15)。

溫度增加，精子活力降低：17℃組的精子細胞活力高于25℃和37℃組，有顯著性差異(P<0.05)(圖16)。

15μg/mL Polybrene降低精子細胞活力：0μg/mL、5μg/mL和10μg/mL各組間精子活力的差異不明顯。15μg/mL組的精子細胞活力顯著低于0μg/mL、5μg/mL和10μg/mL各組(P<0.01)(圖17)。