一種單端孢霉烯族毒素的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法與流程

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法。

背景技術：

由禾谷鐮刀菌引起的麥類赤霉病是一種毀滅性的病害，在亞洲、歐洲、加拿大和美國北部等地頻繁爆發。病菌能在收獲前僅僅幾周的時間內在小麥穗部迅速擴展，阻礙種子形成并使麥粒萎縮，造成嚴重的經濟損失。近年來，隨著全球氣候變化和耕作制度改變，發生區域不斷擴大。赤霉病不僅可造成作物產量嚴重損失，而且其病原物鐮刀菌代謝產生單端孢霉烯族毒素污染食物和飼料可造成人類和動物嚴重疾病和免疫力下降(Pestka and Smolinski 2005)，阻止真核生物蛋白質合成(Ueno et al.，1973)。因此，造成食品安全上的重大隱患。

單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)是一大結構相似的倍半萜烯類化合物，迄今已發現有70多種，是鐮刀菌產生的最重要的真菌毒素。根據化學結構主要可分為A型和B型兩大類：A型包括二乙酰氧基草鐮刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol，DAS)、T-2毒素和HT2毒素等；B型包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol，3ADON)、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol，15ADON)和雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)等。在我國，禾谷鐮刀菌是小麥赤霉病的主要致病菌，也是產生單端孢霉烯族毒素的主要病原菌，嚴重影響了人畜的健康。

目前，真菌毒素的測定方法主要有生物測定法、化學測定法和免疫學測定法。生物測定法是缺乏統一的規范化標準，并且容易受到環境因素的影響，通常僅能用于定性分析。化學測定法是主要的測定方法，具有準確、重復性好的特點，但是要依賴于昂貴的科研儀器，并且前期的提取純化步驟繁瑣，技術要求高，耗時長，難以滿足快速現場檢測的要求。免疫學測定法與化學測定法相比，操作簡單，快速，但依賴于特異性抗體，僅能檢測少數毒素，并且容易受到一些衍生物干擾，假陽性率高，測定結果不夠準確。

近年來，隨著分子生物學的發展，特別是鐮刀菌全基因組序列的公布，國內外科學家在單端孢霉烯族毒素的合成與調控方面取得了重要進展，解析了毒素合成基因簇中各基因以及多個相關調控基因的功能。基于毒素合成及調控基因的序列信息，開發快速且成本低廉的檢測方法逐漸成為科學家研究的熱點。如：Kim等(2003)利用Tri5、Tri7和Tri13基因序列信息開發了檢測NIV和DON毒素的PCR檢測方法，Li等(2005)通過分析Tri5～Tri6基因間 序列信息，設計了區分NIV和DON的檢測引物，該方法穩定性好，適用于大規模檢測。Zhang等(2010)根據Tri11基因開發了特異性引物組合，能夠在一個反應內同時區分DON及其兩種衍生物3ADON、15ADON，取得了很好的效果。但是，這些方法都僅限于檢測部分B型單端孢霉烯族毒素，而無法檢測樣品是否含有T2、HT2等A型單族毒素。因此，應用范圍受到很大限制，制約了這些方法在食品安全中毒素檢測的應用。而且目前尚沒有通過PCR檢測同時檢測A型與B型單端孢霉烯族毒素的報道。除此之外，以上檢測均需要進行在PCR儀上完成聚合酶鏈式反應，對儀器要求較高，并且常規PCR反應及時間長，靈敏度也相對較低。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的等溫擴增技術，因其操作簡單快速、特異性、靈敏度高、成本低等特點，逐漸成為可以替代傳統PCR的新的核酸擴增檢測技術。它是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性在同一反應體系中恒溫高效擴增，大量合成目的DNA的同時，產生副產物-白色焦磷酸鎂沉淀。由于擴增反應依賴于靶DNA的6個獨立的區域，因此特異性非常高，反應在等溫條件下進行，則不需要PCR儀等昂貴設備，僅用水浴鍋等能夠維持穩定恒溫的設備即可完成，檢測成本大大降低，應用范圍顯著擴大，可以在田間進行實時監測。由于LAMP技術多方面的優點，近年來在病原物檢測等方面應用廣泛，但在單端孢霉烯族毒素檢測方面尚無相關報到。

技術實現要素：

發明目的：針對以上存在的問題，本發明的目的是提供一組檢測單端孢霉烯族毒素的LAMP引物組合，能夠同時檢測A型和B型單端孢霉烯族毒素。本發明的另一目的是提供上述單端孢霉烯族毒素的LAMP檢測試劑盒。本發明的另一目的是提供上述單端孢霉烯族毒素的LAMP檢測方法。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種用于檢測單端孢霉烯族毒素的LAMP引物組合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向內引物FIP，反向內引物BIP，正向環引物LB和反向環引物RB組成，各引物序列如下：

FIP：5’-TATTGTTGGCTACCCCAAGGCACCTTGACTCGAACTTCGCC-3’；

BIP：5’-GTCGGCCTTGGTGGTGTCATAAGGCCTTTGCTGAGATGTACC-3’；

F3：5’-CGCCTTACAAAGCCTTGAGA-3’；

B3：5’-TCCGATTGGAGGAGAACACT-3’；

LF：5’-TCCAGGCAAGAAGGAACACCTT-3’；

LB：5’-CGCAATGCGAGAAAGGGCGA-3’；

所述引物組合在檢測單端孢霉烯族毒素中的應用。

一種檢測單端孢霉烯族毒素的LAMP試劑盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物組合的引物混合液，濃度分別為：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1μM、正向內引物FIP 8μM、反向內引物FIP 8μM、正向環引物2μM、反向環引物2μM；

(2)反應液，包含：7mM dNTPs、100mM Tris-HCl，50mM KCl，50mM(NH₄)₂SO₄，40mM MgSO₄、0.5％Triton X-100、5M Betain、40U Bst DNA聚合酶、25mM羥基萘酚藍；

(3)陽性對照為禾谷鐮刀菌NRRL5883的基因組DNA，陰性對照為不含目的基因的反應混合液。

所述的檢測單端孢霉烯族毒素的LAMP試劑盒在檢測單端孢霉烯族毒素中的應用

一種檢測單端孢霉烯族毒素的方法，包括提取待測材料的總DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP引物組或LAMP試劑盒進行LAMP擴增，觀察反應溶液的顏色變化，顯示紫色表示檢測為陰性，不存在單端孢霉烯族毒素，而顯示天藍色的為陽性，樣品中存在單端孢霉烯族毒素。

所述的檢測單端孢霉烯族毒素的方法，提取待測樣品的總DNA，取1μL DNA溶液，加入5μL反應液、5μL引物液、14μL滅菌超純水進行LAMP反應，反應程序為60～65℃，時間為30～50min，擴增產物進行顏色變化的觀察。

本發明檢測單端孢霉烯族毒素的方法，包括待測樣品DNA的提取，以DNA為模板，利用所述引物組合進行LAMP反應。羥基萘酚藍(Hydroxynaphthol blue，HNB)屬于金屬離子指示劑的一種，是Mg²⁺的滴定及劑，其顏色隨溶液PH改變而變化，因此可以通過監測Mg²⁺濃度及PH的變化起到顏色指示劑的作用。反應前將HNB加到反應液中，溶液呈紫色，反應過程中大量形成副產物焦磷酸鎂沉淀，使Mg²⁺濃度下降，PH發生改變，溶液顏色由紫色轉變為天藍色。因此，反應結束后通過反應體系的顏色變化判斷單端孢霉烯族毒素的有無。顯示紫色表示檢測為陰性，不存在單端孢霉烯族毒素，而顯示天藍色的為陽性，樣品中存在單端孢霉烯族毒素。

本發明的關鍵技術之一是單端孢霉烯族毒素的高效特異擴增引物序列及其擴增方法。為了驗證引物序列的特異性，本發明以18株產生A型和B型單端孢霉烯族毒素毒素的不同種鐮刀菌和9株產生其他類型毒素或不產毒素的不同種鐮刀菌為供試材料(表1)，采用快速DNA提取法提取鐮刀菌基因組DNA。具體方法如下：用已滅菌的牙簽或槍頭在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴增的模板。

當發生LAMP反應時，產生大量的焦磷酸鎂沉淀導致濁度上升。通過HNB顯色反應結果所示，產生A型和B型單端孢霉烯族毒素的鐮刀菌樣品反應管里均為天藍色，其為陽性結果，而產生其他種毒素和不產毒素鐮刀菌樣品管均呈紫色，為陰性結果。證明設計的LAMP引物組合具有特異性。說明該引物組合可被用于田間和收獲小麥中單端孢霉烯族毒素快速可靠的檢測鑒定。當用于收獲小麥中單端孢霉烯族毒素檢測時，采用快速裂解法提取總DNA，具體過程如下：將待測小麥樣品加入2mL離心管，并同時加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴增的模板。

有益效果：現有技術相比，本發明的有點和積極效果表現在：

1)檢測范圍廣。與以往報道僅檢測一種或幾種B型毒素的PCR檢測方法相比，本發明能夠同時檢測到A型和B型單端孢霉烯族毒素，擴大了檢測范圍，有利于保障食品安全與糧食安全。

2)特異性強。本發明針對鐮刀菌單端孢霉烯族毒素合成關鍵基因Tri4序列的6個區域設計了4條特異引物，對產毒鐮刀菌進行特異性識別，其特異性強、靈敏度高，使本發明能夠快速準確完成單端孢霉烯族毒素的檢測。

3)操作簡便快捷。本發明提供的檢測單端孢霉烯族毒素的方LAMP法，克服了現有生物與化學檢測方法樣品處理繁瑣，檢測周期長、費時費力及需要PCR熱循環儀等問題。該方法無需PCR反應中的退火、復性等溫度的變化，30～50min內即可完成檢測，大大提高了檢測的效率。

4)成本低。本方法無需昂貴、精密的試驗儀器設備，僅需要恒溫水浴鍋即可完成檢測，且所用DNA快速提取和PCR過程均為常規試劑，價格低廉。

因此本方法實用性強，可滿足田間及收獲小麥中單端孢霉烯族毒素快速檢測，為食品安全提供了保障。

表1 用于檢測引物特異性的產不同種毒素的鐮刀菌菌株

*菌株產生毒素經LC-MS確認

(四)附圖說明

圖1：LAMP引物組合的特異性驗證結果

圖中菌株編號與表1相同，圖中顯示1-18反應管為產生單端孢霉烯族毒素鐮刀菌，檢測結果呈陽性，19-27為產生其他毒素或不產毒鐮刀菌，結果顯示陰性。

圖2：LAMP引物組合的靈敏度試驗結果

1.100ng；2.10ng；3.1ng；4.100pg；5.10pg；6.1pg。圖中顯示25μL反應體系內含有10pg-100ng DNA均顯示陽性，而含有1pg DNA呈陰性，說明反應靈敏度為10pg。

圖3：收獲小麥中單端孢霉烯族毒素檢測結果

1.陽性對照(NRRL5883)；2.江蘇；3.安徽；4.浙江；5.河北；6.河南；7.山東；8.陰性對照(water)。圖中顯示江蘇與安徽樣品呈陽性，含有單端孢霉烯族毒素，而其余樣品呈陰性。

(五)具體實施方式

下面以具體實施例做進一步說明，但本發明不受以下實施例的限制。

實施實例1：單端孢霉烯族毒素LAMP反應的特異性實驗

為了驗證LAMP方法的特異性，以27個種的鐮刀菌為參試對象，其中18個種產生單端孢霉烯族毒素、7個種產生伏馬毒素等其他毒素，2個種不產毒素(表1)。

模板DNA提取：用已滅菌的牙簽或槍頭在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴增的模板。

LAMP反應：取1μL DNA溶液，加入5μL反應液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進行LAMP反應，反應程序為65℃，時間為45min，擴增產物進行顏色變化的觀察。

LAMP檢測結果如圖1所示，18株產生單端孢霉烯族毒素菌株反應管均顯示天藍色的陽性反應，而7株產其他毒素和2株不產毒菌株均呈紫色的陰性反應。

實施實例2：單端孢霉烯族毒素LAMP反應的靈敏度實驗

為了驗證LAMP方法的靈敏度，提取單端孢霉烯族毒素陽性的鐮刀菌菌株NRRL5883(表1)，并采用分光光度計測定DNA濃度(100ng/μL)，用超純水進行10倍梯度稀釋，-20℃保存做模板。分別取各濃度的DNA溶液1μL做模板，加入5μL反應液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進行LAMP反應，反應程序為65℃，時間為45min，擴增產物進行顏色變化的觀察。結果表明(圖2)，加入100ng、10ng、1ng、100pg、10pg DNA的反應管呈明顯天藍色，而加入1pg DNA的反應管呈紫色，表明LAMP反應的靈敏度達到10pg基因組 DNA。

實施實例3：收獲小麥中檢測單端孢霉烯族毒素

模板DNA提取：待測樣品為江蘇、安徽、浙江、河北、河南、山東6個省份收集的收獲

小麥。將待測小麥樣品加入2mL離心管，并同時加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴增的模板。

LAMP反應：取1μL DNA溶液，加入5μL反應液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進行LAMP反應，反應程序為65℃，時間為45min，擴增產物進行顏色變化的觀察。

LAMP檢測結果如圖3所示，采集自江蘇和安徽的小麥樣品呈陽性，表明含有單端孢霉烯族毒素，而浙江、河北、河南、山東采集的樣品為陰性，不含有單端孢霉烯族毒素。