一種快速生長微藻藻株高通量篩選系統(tǒng)和方法與流程

            文檔序號(hào):11808227閱讀:455來源:國知局
            一種快速生長微藻藻株高通量篩選系統(tǒng)和方法與流程

            本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體的說是一種基于凝膠液滴微流控技術(shù)中液滴微流控技術(shù)的單細(xì)胞水平快速生長微藻藻株的高通量篩選系統(tǒng)和方法。



            背景技術(shù):

            微藻是一類古老的低等植物,廣泛地分布在海洋、淡水湖泊等水域,可直接利用陽光、二氧化碳和含氮、磷等元素的簡單營養(yǎng)物質(zhì)快速生長。微藻細(xì)胞中含有多種高價(jià)值的營養(yǎng)成分和化工原料,細(xì)胞代謝產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)、色素等,在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、動(dòng)物飼料、環(huán)境檢測(cè)及凈化、生物技術(shù)以及可再生能源制造等方面有廣泛應(yīng)用。藻類養(yǎng)殖是人工控制下藻類繁殖、生長的生產(chǎn)過程,篩選出快速生長微藻藻株對(duì)于降低養(yǎng)殖成本、提高培養(yǎng)效率具有重大意義。

            傳統(tǒng)篩選方法多采用測(cè)序、PCR或是有特定響應(yīng)機(jī)制的方法來進(jìn)行藻株篩選,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,既無法高效快速地獲取單細(xì)胞,也不能對(duì)有特定表型藻株進(jìn)行精確的高通量分離。發(fā)展單細(xì)胞水平快速生長微藻藻株的高通量篩選方法可以解決上述問題。微流控系統(tǒng)為其提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐,其靈活、高通量、準(zhǔn)確度高的操作檢測(cè)系統(tǒng)為微藻藻株的高通量篩選提供了簡單易操作的解決方案。



            技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

            針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足之處,本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于凝膠液滴微流控技術(shù)的單細(xì)胞水平快速生長微藻藻株的高通量篩選系統(tǒng)和方法,為目前微藻生長表型篩選周期長、難于分離的技術(shù)瓶頸提供了解決方案。

            本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種快速生長微藻藻株高通量篩選系統(tǒng),包括:

            單分散單細(xì)胞包裹單元,用于驅(qū)動(dòng)含分散于凝膠培養(yǎng)基中的細(xì)胞/顆粒在其 中的凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片中流動(dòng),通過含表面活性劑的油相剪切作用使分散相細(xì)胞液被擠壓形成單分散單細(xì)胞液滴,并通過微管導(dǎo)出凝膠液滴于EP管并冷凝成單細(xì)胞凝膠微球;

            中間處理單元,用于對(duì)單細(xì)胞凝膠微球進(jìn)行增殖,并經(jīng)濃縮使單細(xì)胞凝膠微球在顯微鏡觀察下呈堆疊狀態(tài),將濃縮后的單細(xì)胞凝膠微球分散于黃原膠中;

            再注入分選單元,用于對(duì)所需突變體進(jìn)行篩選分離。

            所述單分散單細(xì)胞包裹單元包括:

            第一微量進(jìn)樣器,為兩個(gè),其中一個(gè)用于驅(qū)動(dòng)含凝膠的培養(yǎng)液形成的分散相液體,另一個(gè)用于驅(qū)動(dòng)油相和表面活性劑混合形成的連續(xù)相液體,通過微管分別連接凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片的兩個(gè)入口;

            凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片,用于通過其中的微通道生成微藻凝膠構(gòu)成的單分散單細(xì)胞液滴;

            EP管,通過微管將凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片出口的單分散單細(xì)胞液滴導(dǎo)入到EP管中;

            冰水浴,用于對(duì)置于其中的EP管進(jìn)行冷凝處理。

            所述凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片由上下兩層PDMS基片鍵合而成,內(nèi)部包括寬100~200um,深30~70um的微通道網(wǎng)絡(luò),該微通道網(wǎng)絡(luò)的入口包括含表面活性劑的油相進(jìn)樣口和含凝膠培養(yǎng)基的藻液進(jìn)樣口,含表面活性劑的油相進(jìn)樣口連通一個(gè)環(huán)狀通道,并在所述環(huán)狀通道的另一端與含凝膠培養(yǎng)基的藻液進(jìn)樣口所連通的通道匯合于單細(xì)胞單分散液滴包裹產(chǎn)生通道,并引出一條通道連通道收集出口。

            所述再注入分選單元包括:

            第二微量進(jìn)樣器,為三個(gè),其中一個(gè)用于驅(qū)動(dòng)分散相的分散于黃原膠中的單細(xì)胞凝膠微球,第二個(gè)用于驅(qū)動(dòng)連續(xù)相的PBST,第三個(gè)用于驅(qū)動(dòng)連續(xù)相的側(cè)流PBST,通過微管分別連接再注入分選微流控芯片的三個(gè)入口;

            再注入分選微流控芯片,用于通過其中的微通道收集凝膠微球;

            電磁閥,連接再注入分選微流控芯片,用于在再注入分選微流控芯片的微通道中產(chǎn)生瞬時(shí)吸力;

            圖像采集單元,用于篩選過程的圖像采集。

            所述再注入分選微流控芯片由上下兩層PDMS基片鍵合而成,內(nèi)部包括寬100~150um,深80~150um的微通道網(wǎng)絡(luò),該微通道網(wǎng)絡(luò)的入口包括PBST水相進(jìn)樣口、增殖后凝膠微球進(jìn)樣口和側(cè)流水相入口,PBST水相進(jìn)樣口連通一個(gè)環(huán)狀通道,并在所述環(huán)狀通道的另一端與增殖后凝膠微球進(jìn)樣口所連通的通道匯合,匯合后引出的通道與分選通道連通,分選通道還連通側(cè)流水相入口、電磁閥連通通道、廢液口和收集通道口,所述電磁閥連通通道用于在電電磁閥開啟的瞬間使凝膠微球在吸力的作用下流向收集通道,所述廢液口和收集通道口所在的通道之間有細(xì)小的連通通道。

            一種快速生長微藻藻株高通量篩選方法,包括以下步驟:

            單細(xì)胞凝膠液滴包裹生成階段:通過第一微量進(jìn)樣器將含凝膠的培養(yǎng)液形成的分散相液體,和油相和表面活性劑混合形成的連續(xù)相液體驅(qū)動(dòng)到凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片中,生成單分散單細(xì)胞液滴;

            離線收集培養(yǎng)階段:通過微管使凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片的收集出口與置于冰水浴中的EP管連通,使單分散單細(xì)胞液滴導(dǎo)出至EP管中;并進(jìn)行后處理,使處理完畢的凝膠微球重新分散于微藻培養(yǎng)基中,并置于微量培養(yǎng)瓶于恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng);

            離線培養(yǎng)過程監(jiān)測(cè)階段:隔時(shí)采樣,通過隨機(jī)取樣對(duì)微量培養(yǎng)瓶中的凝膠微球進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,并對(duì)有微藻細(xì)胞增殖的凝膠放大圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以完成在單細(xì)胞水平的微藻生長監(jiān)測(cè);

            凝膠微球的再注入及分選階段:對(duì)收集培養(yǎng)完畢的凝膠微球做中間處理并作為分散相,以PBST作為連續(xù)相,通過第二微量進(jìn)樣器的驅(qū)動(dòng),使凝膠微球和PBST分別注入對(duì)應(yīng)微通道,凝膠微球在連續(xù)相作用下在再注入分選微流控芯片的微通道內(nèi)有序流動(dòng),有序流動(dòng)的凝膠微球經(jīng)過分選通道時(shí),通過圖像采集系 統(tǒng)對(duì)凝膠微球進(jìn)行逐一識(shí)別判定,當(dāng)某凝膠微球?yàn)樗枭L表型時(shí),開啟電磁閥,使凝膠微球在瞬時(shí)吸力作用下流向收集通道口。

            所述單細(xì)胞凝膠液滴包裹生成階段包括以下步驟:

            1)將微藻細(xì)胞洗滌,并用含凝膠的培養(yǎng)液調(diào)至OD值為0.5~0.8,形成懸浮成液分散相,油相和表面活性劑混合形成連續(xù)相;

            2)將分散相液體驅(qū)動(dòng)到經(jīng)含凝膠培養(yǎng)基的藻液進(jìn)樣口,將連續(xù)相液體驅(qū)動(dòng)到含表面活性劑的油相進(jìn)樣口,在凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片中的微通道中,連續(xù)生成微藻凝膠微液滴,部分液滴中包裹不超過一個(gè)微生物細(xì)胞;

            3)通過凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片流體聚焦結(jié)構(gòu)剪切形成單分散單細(xì)胞液滴。

            所述后處理具體為:從單細(xì)胞單分散包裹芯片收集出的凝膠微球用冰水浴進(jìn)行固化1-3小時(shí),固化完成后,使用細(xì)胞過濾器除去凝膠微球外層的油相。

            所述中間處理具體為:將收集培養(yǎng)完畢的凝膠微球濃縮至在顯微鏡下呈堆疊狀態(tài)的濃度,并混懸于黃原膠中。

            所述分選通道連通側(cè)流水相口,在側(cè)流水相作用下,默認(rèn)分選通道中的液體流向廢液通道。

            本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:

            1.本發(fā)明所構(gòu)建的基于凝膠液滴的微藻藻株生長表型篩選方法有效地結(jié)合了基于液滴單細(xì)胞增殖的高準(zhǔn)確性和其他檢測(cè)篩選方法的高效率特點(diǎn),為微藻篩選的高效、高準(zhǔn)確率提供了系統(tǒng)和方法。

            2.本發(fā)明通過凝膠液滴細(xì)胞包裹的方法,快速高通量地獲取了單細(xì)胞,可很好地解決傳統(tǒng)方法極難獲取單細(xì)胞水平分析的技術(shù)瓶頸。

            3.本發(fā)明基于電磁閥的分選系統(tǒng)操作簡便、準(zhǔn)確度高、耗時(shí)少,可以很好地滿足特定表型藻株的篩選,尤其對(duì)于突變率較低的菌株,此系統(tǒng)和方法更為適用。

            附圖說明

            圖1為單細(xì)胞水平快速生長微藻藻株高通量篩選系統(tǒng)組成圖;

            其中圖A為單分散單細(xì)胞包裹單元,包括:1、第一微量進(jìn)樣器;2、凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片;3、EP管;4、冰水??;

            圖B為再注入分選單元,包括:5、第二微量進(jìn)樣器;6、再注入分選微流控芯片;7、電磁閥;8、圖像采集單元;

            圖2為凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片設(shè)計(jì)示意圖;

            其中,9、含表面活性劑的油相進(jìn)樣口;10、含凝膠培養(yǎng)基的藻液進(jìn)樣口;11、單細(xì)胞單分散液滴包裹產(chǎn)生通道;12、收集出口;

            圖3為再注入分選微流控芯片設(shè)計(jì)示意圖;

            其中,13、PBST水相進(jìn)樣口;14、增殖后凝膠微球進(jìn)樣口;15、側(cè)流水相口入口;16、電磁閥連通通道;17、分選通道;18、廢液口;19、收集通道口。

            具體實(shí)施方式

            下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

            如圖1所示,本實(shí)例所構(gòu)建的基于液滴凝膠技術(shù)的雨生紅球藻單細(xì)胞快速生長微藻藻株的高通量篩選系統(tǒng)和方法,該系統(tǒng)包括單分散單細(xì)胞包裹單元A和再注入分選單元B。單分散單細(xì)胞包裹單元A用于驅(qū)動(dòng)含分散于凝膠培養(yǎng)基中的細(xì)胞/顆粒在其中的凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2中流動(dòng),通過含表面活性劑的油相剪切作用使分散相細(xì)胞液被擠壓形成單分散單細(xì)胞液滴,并通過微管導(dǎo)出凝膠液滴于EP管3并冷凝成單細(xì)胞凝膠微球。再注入分選單元B,用于對(duì)所需突變體進(jìn)行篩選分離。在單分散單細(xì)胞包裹單元A和再注入分選單元B之間還包括中間處理單元,采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備對(duì)單細(xì)胞凝膠微球進(jìn)行增殖,并經(jīng)濃縮使單細(xì)胞凝膠微球在顯微鏡觀察下呈堆疊狀態(tài),將濃縮后的單細(xì)胞凝膠微球分散于黃原膠中。

            單分散單細(xì)胞包裹單元A包括:第一微量進(jìn)樣器1,為兩個(gè),其中一個(gè)用 于驅(qū)動(dòng)含凝膠的培養(yǎng)液形成的分散相液體,另一個(gè)用于驅(qū)動(dòng)油相和表面活性劑混合形成的連續(xù)相液體,通過微管分別連接凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2的兩個(gè)入口;凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2,用于通過其中的微通道生成微藻凝膠構(gòu)成的單分散單細(xì)胞液滴;EP管3,通過微管將凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2出口的單分散單細(xì)胞液滴導(dǎo)入到EP管3中;冰水浴4,用于對(duì)置于其中的EP管3進(jìn)行冷凝處理。

            所述再注入分選單元B包括:第二微量進(jìn)樣器5,為三個(gè),其中一個(gè)用于驅(qū)動(dòng)分散相的分散于黃原膠中的單細(xì)胞凝膠微球,第二個(gè)用于驅(qū)動(dòng)連續(xù)相的PBST,第三個(gè)用于驅(qū)動(dòng)連續(xù)相的側(cè)流PBST,通過微管分別連接再注入分選微流控芯片6的三個(gè)入口。再注入分選微流控芯片6,用于通過其中的微通道收集凝膠微球。電磁閥7,連接再注入分選微流控芯片6,用于在再注入分選微流控芯片6的微通道中產(chǎn)生瞬時(shí)吸力。圖像采集單元8,用于篩選過程的圖像采集,可采用高速CCD或在實(shí)驗(yàn)中采用顯微鏡。

            如圖2所示,凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2由上下兩層PDMS基片鍵合而成,上層包括寬100~200um,深30~70um的微通道網(wǎng)絡(luò),下層為PDMS基片。上下基片清洗后使用等離子體進(jìn)行鍵合。該微通道網(wǎng)絡(luò)的入口包括含表面活性劑的油相進(jìn)樣口9和含凝膠培養(yǎng)基的藻液進(jìn)樣口10,含表面活性劑的油相進(jìn)樣口9連通一個(gè)環(huán)狀通道,并在所述環(huán)狀通道的另一端與含凝膠培養(yǎng)基的藻液進(jìn)樣口10所連通的通道匯合于單細(xì)胞單分散液滴包裹產(chǎn)生通道11,并引出一條通道連通道收集出口12。樣品進(jìn)行微生物富集預(yù)處理等后形成150μL懸浮液(其中含有培養(yǎng)基、液態(tài)凝膠、雨生紅球藻微藻細(xì)胞)。油相加入適當(dāng)濃度的表面活性劑,以兩臺(tái)微量進(jìn)樣泵作為驅(qū)動(dòng)力,分別使其分別進(jìn)入凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2的微通道網(wǎng)絡(luò)。流體在閉合的微通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)進(jìn)行有序流動(dòng),形成單分散微生物細(xì)胞包裹液滴,并通過微管收集到置于冰水浴4的EP管3中,經(jīng)一系列后處理,重新分散在培養(yǎng)基中控溫培養(yǎng),間隔時(shí)間采樣,用隨機(jī)取樣的方法,對(duì)微量培養(yǎng)瓶中的凝膠微球進(jìn)行取樣,通過倒置顯微鏡的明場(chǎng)對(duì)樣品進(jìn)行放大采集圖像, 再用圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)一步處理,并對(duì)有雨生紅球藻增殖的凝膠進(jìn)行監(jiān)測(cè),據(jù)此完成單細(xì)胞雨生紅球藻的生長機(jī)理監(jiān)測(cè)。

            增殖一段時(shí)間后的凝膠微球經(jīng)再注入分選單元分離。如圖3所示,再注入分選微流控芯片(6)由上下兩層PDMS基片鍵合而成,上層包括寬100~150um,深80~150um的微通道網(wǎng)絡(luò),下層為PDMS基片,上下基片清洗后使用等離子體進(jìn)行鍵合。該微通道網(wǎng)絡(luò)的入口包括PBST水相進(jìn)樣口13、增殖后凝膠微球進(jìn)樣口14和側(cè)流水相入口15,PBST水相進(jìn)樣口13連通一個(gè)環(huán)狀通道,并在所述環(huán)狀通道的另一端與增殖后凝膠微球進(jìn)樣口14所連通的通道匯合,匯合后引出的通道與分選通道17連通,分選通道17還連通側(cè)流水相入口15、電磁閥連通通道16、廢液口18和收集通道口19,所述電磁閥連通通道16用于在電電磁閥7開啟的瞬間使凝膠微球在吸力的作用下流向收集通道19,所述廢液口18和收集通道口19所在的通道之間有細(xì)小的連通通道。

            為使親水流體能更好地在微通道流動(dòng),使用之前采用親水試劑對(duì)其進(jìn)行親水化處理。增至一段時(shí)間后的凝膠微球經(jīng)濃縮,重新分散于黃原膠中,分散相加入適當(dāng)濃度的PBST,側(cè)流流體同樣采用PBST,通過三臺(tái)注射泵以適當(dāng)速率比,使凝膠微球默認(rèn)向廢液通道流動(dòng),并接入電磁閥。當(dāng)凝膠微球中單細(xì)胞雨生紅球藻增殖速率超過某一閾值,即可判定為所需表型藻株,此時(shí)開啟電磁閥,該凝膠微球在電磁閥的瞬間吸力作用下進(jìn)入收集通道。

            本發(fā)明方法,包括以下步驟:

            單細(xì)胞凝膠液滴包裹生成階段:通過第一微量進(jìn)樣器1將含凝膠的培養(yǎng)液形成的分散相液體,和油相和表面活性劑混合形成的連續(xù)相液體驅(qū)動(dòng)到凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2中,生成單分散單細(xì)胞液滴;

            離線收集培養(yǎng)階段:通過微管使凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2的收集出口12與置于冰水浴4中的EP管3連通,使單分散單細(xì)胞液滴導(dǎo)出至EP管3中;并進(jìn)行后處理,使處理完畢的凝膠微球重新分散于微藻培養(yǎng)基中,并置于微量培養(yǎng)瓶于恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng);

            離線培養(yǎng)過程監(jiān)測(cè)階段:隔時(shí)采樣,通過隨機(jī)取樣對(duì)微量培養(yǎng)瓶中的凝膠微球進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,并對(duì)有微藻細(xì)胞增殖的凝膠放大圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以完成在單細(xì)胞水平的微藻生長監(jiān)測(cè);

            凝膠微球的再注入及分選階段:對(duì)收集培養(yǎng)完畢的凝膠微球做中間處理并作為分散相,以PBST作為連續(xù)相,通過第二微量進(jìn)樣器5的驅(qū)動(dòng),使凝膠微球和PBST分別注入對(duì)應(yīng)微通道,凝膠微球在連續(xù)相作用下在再注入分選微流控芯片6的微通道內(nèi)有序流動(dòng),有序流動(dòng)的凝膠微球經(jīng)過分選通道17時(shí),通過圖像采集系統(tǒng)8對(duì)凝膠微球進(jìn)行逐一識(shí)別判定,當(dāng)某凝膠微球?yàn)樗枭L表型時(shí),開啟電磁閥7,使凝膠微球在瞬時(shí)吸力作用下流向收集通道口19。

            所述單細(xì)胞凝膠液滴包裹生成階段包括以下步驟:

            1)將微藻細(xì)胞洗滌,并用含凝膠的培養(yǎng)液調(diào)至OD值為0.5~0.8,形成懸浮成液分散相,油相和表面活性劑混合形成連續(xù)相;

            2)將分散相液體驅(qū)動(dòng)到經(jīng)含凝膠培養(yǎng)基的藻液進(jìn)樣口10,將連續(xù)相液體驅(qū)動(dòng)到含表面活性劑的油相進(jìn)樣口9,在凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2中的微通道中,連續(xù)生成微藻凝膠微液滴,部分液滴中包裹不超過一個(gè)微生物細(xì)胞;

            3)通過凝膠液滴單細(xì)胞包裹芯片2流體聚焦結(jié)構(gòu)剪切形成單分散單細(xì)胞液滴。

            所述后處理具體為:從單細(xì)胞單分散包裹芯片收集出的凝膠微球用冰水浴進(jìn)行固化1-3小時(shí),優(yōu)選2小時(shí),固化完成后,使用細(xì)胞過濾器除去凝膠微球外層的油相。

            所述中間處理具體為:將收集培養(yǎng)完畢的凝膠微球濃縮至在顯微鏡下呈堆疊狀態(tài)的濃度,并混懸于黃原膠中。

            所述分選通道17連通側(cè)流水相口15,在側(cè)流水相作用下,默認(rèn)分選通道17中的液體流向廢液通道18。

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