從脂肪來源間充質干細胞制備誘導多能干細胞的方法及利用該方法制備的誘導多能干細胞與流程

本發明涉及來源于人體脂肪的間充質干細胞的多能干細胞誘導培養基組合物及利用其來制備患者特異性誘導多能干細胞的方法。

背景技術：

干細胞是從各個組織獲得的被分化之前步驟的未分化細胞的總稱。干細胞具有可在未分化狀態下在規定期間內持續制造出與自身相同的細胞的性質以及在適當的條件下可分化成構成生物組織的各種細胞的性質。

根據分化能力和生成時期，干細胞可分為胚胎干細胞(embryonic stem cell)和成體干細胞(adult stem cell)。其他分類基于干細胞的分化能力，上述干細胞可分為多能(pluripotency)干細胞、多分化能(multipotency)干細胞及單分化能(unipotency)干細胞。

成體干細胞可分為多分化能或單分化能干細胞。具有代表性的成體干細胞為間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)。間充質干細胞分化成軟骨細胞(chondrocyte)、成骨細胞(osteoblast)、脂肪細胞(adipocyte)、肌肉細胞(myocyte)、神經細胞(neuron)，造血干細胞分化成紅細胞、白細胞、血小板等主要血液內的血細胞。

相反，多能干細胞均可被分化成構成生物體的三種胚層(germ layer)，由此，多能干細胞是指具有均可分化成人體的所有細胞或臟器組織的多功能性的干細胞，通常，多功能干細胞為胚胎細胞。人類胚胎干細胞來源于可變為人類生命體的胚胎，因此存在多種倫理問題，但是，與成體干細胞相比，人類胚胎干細胞具有優秀的細胞增殖及分化能力。成體干細胞可從骨髓、血液、大腦、皮膚等獲得，因此存在很少的倫理問題，但是，與胚胎干細胞相比，成體干細胞具有限定的分化能力。

為了解決上述問題，進行了用于通過使來源于成體的細胞重編程來制備與胚胎細胞類似的特異性多功能細胞的多種方法。作為代表性方法，具有細胞融合法(fusion with ES cell)、體細胞核移植法(somatic cell nuclear transfer)、特定因子注入法(reprogramming by gene factor)等。細胞融合法因誘導的細胞還具有兩對基因，由此在細胞的穩定性方面存在問題，體細胞核移植法存在需要大量卵子且效率極低的問題。而且，特定因子注入法是為了通過插入特定基因來誘導重編程而利用包含致癌基因的病毒的方法，上述方法存在高的致癌危險，且因低效率和方法方面上的難度，而在細胞治療劑開發可能性方面存在問題。

為了成功且大量獲得多能干細胞，在培養分離的來源于臍帶的單核細胞的步驟中的培養組合物極為重要，且需要進行通過高效率的誘導方法，以更多的量制備多能干細胞的研究。

另一方面，曾有過將腔昆布使用于治療或預防過敏性疾病的組合物(韓國公開專利第2009-0043115號)或者氧化染色用染毛劑組合物(韓國公開專利第2012-0126148號)的情況，但尚未以用于將脂肪來源間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell)重編程為誘導多能干細胞(induced pluripotency stem cell)的用途來使用。

通過上述背景技術說明的事項僅是為了進一步理解本發明的背景，上述背景技術相當于本發明所屬技術領域的普通技術人員所知道的現有技術。

技術實現要素：

技術問題

本發明人員為了安全性和生產效率高的細胞治療劑開發的實用化，而尋找以高效率誘導多能干細胞的方法。結果，在向細胞培養基添加作為安全的天然提取物的腔昆布提取物的情況下，確認了可利用脂肪來源間充質干細胞安全且高效地制備誘導多能干細胞，由此完成了本發明。

因此，本發明的目的在于，提供用于將包含腔昆布提取物的脂肪來源間充質干細胞重編程為誘導多能干細胞的培養基組合物。

本發明的再一目的在于，提供包括在包含腔昆布提取物的培養基中，將脂肪來源間充質干細胞重編程為誘導多能干細胞的步驟的誘導多能干細胞的制備方法。

本發明的另一目的在于，提供通過上述誘導多能干細胞的制備方法來制備的誘導多能干細胞。

本發明的還有一目的在于，提供包含從患者的脂肪分離干細胞并通過上述誘導多能干細胞的制備方法來制備的誘導多能干細胞的患者特異性細胞治療用組合物。

通過下述的具體實施方式、發明要求保護范圍及附圖更加明確本發明的其他目的及優點。

解決問題的方案

根據本發明的一實施方式，本發明提供用于將包含腔昆布(Ecklo nia cava)提取物的脂肪來源間充質干細胞重編程為誘導多能干細胞培養基組合物。

本發明人努力尋找在沒有破壞胚胎的倫理問題并不使用病毒的情況下，以高效率誘導用于在形成癌細胞方面沒有危險的安全性和生產效率高的細胞治療劑開發的實用化的多能干細胞的方法。結果，向細胞培養基添加作為安全的天然提取物的腔昆布提取物的情況下，確認了可高效制備誘導多能干細胞。

作為有效成分包含在本發明的培養基組合物的腔昆布(甘苔)為主要在南海岸、濟州島海岸一代及郁陵島海岸一代棲息的褐藻植物昆布目昆布科的多年生海藻類，主要為鮑魚和海螺等的食物，且為制備褐藻酸或碘化鉀的主要原料或用于食用。

本發明所包含的腔昆布提取物可利用水、(a)碳數1～4的無水或含水低級乙醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、異丙醇及正丁醇等)、(b)上述低級乙醇和水的混合溶劑、(c)丙酮、(d)乙酸乙酯、(e)氯仿、(f)1，3-丁二醇、(g)己烷、(h)二乙醚等的有機溶劑來提取，優選地，可利用甲醇或乙醇和水和混合溶劑或者利用它們中的各個來提取。在利用混合溶劑提取腔昆布提取物的情況下，優選地，甲醇或乙醇的含量為50～80v/v％。

目前，用于將上述腔昆布提取物適用于化妝品等皮膚組合物的事例子在增加(參照韓國公開專利第2013-0017159號、第2012-0040488號、第2010-0097293號)，但尚未有過將上述腔昆布提取物開發成多能干細胞誘導用培養的事例。

本發明所使用的術語“胚胎干細胞”作為從受精后繁殖初期的胚泡(blastocyst)的內細胞團(inner cell mass)分離并培養的細胞，是指具有多能性的細胞。本發明所使用的術語“多能干細胞”為具有可分化成構成生物體的三種胚層，即，內胚層(endoderm)、中胚層(mesoderm)、外胚層(ectoderm)的多能性的干細胞。

本發明所使用的術語“分化(differentiation)”是指在細胞分裂增殖并成長的期間，結構或功能相互特殊化的現象，即，生物的細胞、組織等為了執行各自所負責的任務而發生形態或功能變化。

本發明所使用的術語“細胞治療劑”為通過從人分離、培養及特殊操作制備的細胞及組織，細胞治療劑作為用于治療、診斷及預防的醫藥品，為了使細胞或組織的功能恢復，在體外增殖或篩選同種或異種細胞，或者用于通過以其他方法改變細胞的生物學特性等一系列的行為來進行治療、診斷及預防的醫藥品。根據細胞的分化程度，細胞治療劑大體分為體細胞治療劑、干細胞治療劑，尤其，本發明涉及干細胞治療劑。

本發明的“間充質干細胞”為從來源于哺乳動物的胚胎干細胞或成體干細胞分離的細胞，優選地，間充質干細胞為脂肪來源間充質干細胞，更加優選地，間充質干細胞為來源于人體的脂肪的間充質干細胞。上述脂肪來源干細胞可從人體的脂肪組織提取。可通過多種方式從脂肪提取間充質干細胞，例如，為了從脂肪組織分離單核細胞而從人體提取脂肪組織并通過杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline，DPBS)沖洗脂肪組織至不再出血，且以手術用刀片鉸碎洗完的臍帶，在37℃的溫度下，進行孵化(incubation)，從而可獲得包含單核細胞的溶液。

本發明所使用的術語“培養基”是指在包含糖、氨基酸和各種營養物、血清、生長因子、無機物等的細胞的成長及增殖等所需要的要素的體外(in vitro)，用于干細胞等的細胞的培養或分化的混合物。

尤其，本發明的培養基為用于培養間充質干細胞的培養基。此時，間充質干細胞為從來源于哺乳動物的胚胎干細胞或成體干細胞分離的細胞，上述間充質干細胞為具有可無限定地增殖的能力及可分化成多種細胞形態(例如，脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、骨細胞等)的細胞。并且，在本發明中，使用具有對CD44、CD73、CD90的抗體產生陽性反應且對CD34、CD45的抗體產生陰性反應的免疫表型的多分化能間充質干細胞。

在本發明所屬技術領域中銷售多種培養基，也可人工制備培養基來使用。作為一例，正在銷售的培養基具有達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM，Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、最小必需培養基(MEM，Minimal Essential Medium)、伊格爾基本培養基(BME，Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10，F-12、達爾伯克改良伊格爾培養基-F12(DMEM-F12)、α-最小必需培養基(α-MEM，α-Minimal Essential Medium)、G-最小必需培養基(G-MEM，Glasgow’s Minimal Essential Medium)、IMPM(IMDM，Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、AmnioMax、新型二代羊水培養基(AminoMaxⅡcomplete Medium，Gibco，Newyork，USA)、Chang’s培養基、MesemCult-XF培養基(STEMCELL Technologies，Vancouver，Canada)等，間充質干細胞無血清培養基等，能夠與可人工制備的培養基一同使用包含在本發明的培養基組合物中的基本培養基。

可向上述基本培養基添加通常添加的血清成分(例如，胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum))及抗生劑(例如，青霉素、鏈霉素)等。向上述基本培養基添加的血清成分或抗生劑成分的濃度可在實現本發明的效果的范圍內改變，優選地，可添加10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的鏈霉素等。

并且，本發明的培養基還可包含營養混合物(Nutrient Mixture)。上述營養混合物為包含通常用于細胞培養的各種氨基酸、維生素、無機鹽等的混合物，混合上述氨基酸、維生素、無機鹽等來制備營養混合物，或者可使用商業性制備的營養混合物。商業性制備的營養混合物可舉M199、MCDB110、MCDB202、MCDB302等，但并不局限于此。

并且，本發明的培養基為了多能干細胞的誘導和穩定化而還可包含能量水。優選地，還包含0.01至10v/v％的上述能量水，更加優選地，還包含0.05至0.5v/v％的能量水。

本發明的培養基組合物為對多能干細胞誘導特異性培養基，可通過向上述基本培養基添加腔昆布提取物來形成培養基混合物，優選地，以總培養基組合物為基準，能夠以1至1000μg/ml的濃度包含腔昆布提取物，更加優選地，以10至400μg/ml的濃度包含腔昆布提取物。

根據本發明的再一實施方式，本發明提供誘導多能干細胞的制備方法，包括：向細胞培養基添加腔昆布提取物的步驟；以及在上述培養基中，將脂肪來源間充質干細胞重編程為誘導多能干細胞的步驟。

根據本發明的一實施例，作為實驗組，利用包含本發明的腔昆布提取物培養基組合物(在達爾伯克改良伊格爾培養基-F12包含有腔昆布提取物及能量水的培養基)，作為對照組，僅利用達爾伯克改良伊格爾培養基-F12，與這些情況不同地，第8～10天可確認到形成了多能干細胞集落(圖2及圖3).

本發明的另一實施方式，本發明提供通過上述誘導多能干細胞的制備方法來制備的誘導多能干細胞。

本發明的誘導多能干細胞具有與胚胎干細胞相同的分化能力，而且，誘導多能干細胞的細胞模樣也幾乎與胚胎干細胞相同(圖2及圖3)。根據本發明的一實施例，調查在胚胎干細胞中是否存在特異性基因(Oct4、Sox)及蛋白質(階段特異性胚胎表面抗原-4(SSEA-4))的表達的結果，在通過本發明誘導的多能干細胞中，與胚胎干細胞相同，確認了上述基因及蛋白質的表達(圖4及圖5)。

根據另一實施例，在未經過誘導過程的間充質干細胞中，作為多能干細胞的特異性基因的OCT4、SOX2和Nanog的表達度低，相反，在通過本發明的方法誘導的多能干細胞(實驗列1-1：EtOH EPN，實驗列1-2：Sonic EPN)中，這些特異性基因的表達度明顯高(圖6及圖7)。

根據還有一實施方式，本發明提供包含通過上述誘導多能干細胞的制備方法來制備的誘導多能干細胞的細胞治療用組合物。

本發明的組合物可通過任意的給藥路徑，具體地，可通過腹腔或胸腔給藥、皮下給藥、靜脈或動脈血管內給藥、肌肉內給藥、基于注射的局部給藥等的方法給藥。

在本發明中，上述組合物可基于通常的方法，以注射劑、懸浮劑、乳化劑等的形式給藥，根據需要，上述組合物懸浮在弗氏完全佐劑等的佐劑，或者與具有如BCG的佐劑活性的物質一同給藥。上述組合物可被滅菌，或者可包含穩定劑、可濕性粉劑或乳化促進劑、用于調節滲透壓的鹽或緩沖劑等的佐劑及其他治療性有效物質。

本發明的細胞治療用組合物可適用于關節炎、神經系統疾病、內分泌疾病、肝病等，之后，根據對于人的臨床實驗結果，也可用作對于人的同種細胞治療劑。

發明的效果

概述本發明的特征及優點如下。

(i)本發明提供包含腔昆布提取物的誘導多能干細胞重編程用培養基組合物。

(ii)并且，本發明提供利用上述培養基組合物的誘導多能干細胞的制備方法。

(iii)若利用本發明的培養基組合物，則可通過利用脂肪來源間充質干細胞來有效制備誘導多能干細胞，所制備的多能干細胞可分化成多種細胞，因此，可用作細胞治療劑。

(iv)在本發明中，制備具有與胚胎干細胞相同的分化能力的多能干細胞，從而不使用胚胎干細胞，因此消除因胚胎的破壞而產生的倫理問題，并且不使用可致癌的病毒，因而可制備在形成癌細胞方面沒有危險的安全的多能干細胞。

(v)進而，使用天然提取物，因此相比于以往的方法，可非常容易并以明顯高的效率來制備多能干細胞，利用從患者的脂肪細胞分離的間充質干細胞，因而期待可提前實現患者特異性干細胞治療劑的實用化。本發明被認為在治療神經系統疾病、免疫疾病等多種疑難病疾病的方面，將會作出巨大奉獻。

附圖說明

圖1為示出在脂肪來源間充質干細胞中通過注入腔昆布提取物培養基來培養時，幾乎與胚胎干細胞相同的多能干細胞被誘導的圖。

圖2示出通過本發明的方法(實驗例1-1)形成根據腔昆布提取物(乙醇提取物)的濃度誘導的多能干細胞集落。

圖3示出通過本發明的方法(實驗例1-2)形成根據腔昆布提取物(水提取物)的濃度誘導的多能干細胞集落。

圖4為利用特異性蛋白質的表達來將通過本發明的方法(實驗例1-1)誘導的多能干細胞確認為多能干細胞的圖。

圖5為利用特異性蛋白質的表達來將通過本發明的方法(實驗例1-2)誘導的多能干細胞確認為多能干細胞的圖。

圖6示出通過本發明的方法(實驗例1-1)誘導的多能干細胞的基因表達并通過曲線圖來圖示。

圖7示出通過本發明的方法(實驗例1-2)誘導的多能干細胞的基因表達并通過曲線圖來圖示。

具體實施方式

以下，通過實施例，更加詳細說明本發明。上述實施例僅用于更加詳細說明本發明，本發明所屬技術領域的普通技術人員知道，根據本發明的主旨，本發明的范圍并不局限于上述實施例。

實施例

實施例1：腔昆布提取物的制備

實施例1-1：利用乙醇溶劑的腔昆布提取物的制備

實驗中使用的生藥試樣從濟州島購買并經過專家的準確鑒定之后用于實驗。將100g的干燥的生藥試樣放入1l的70％乙醇中并對乙醇進行回流提取16小時，并利用過濾紙進行了過濾。在旋轉式汽化器中，對濾液進行濃縮，并即時進行冷凍干燥。

實施例1-2：利用水的腔昆布提取物的制備

實驗中使用的生藥試樣從濟州島購買并經過專家的準確鑒定之后用于實驗。將100g的干燥的生藥試樣放入1l的水中并利用超聲波提取儀提取16小時，并利用過濾紙進行了過濾。在旋轉式汽化器中，對濾液進行濃縮，并即時進行冷凍干燥。

實施例2：從人體脂肪組織分離間充質干細胞及培養

實施例2-1：人體脂肪組織的提取

在吸入脂肪之后直接收集脂肪組織。向實驗室移動試樣之前，在500ml的滅菌玻璃瓶中收集已吸入的脂肪組織。之后，密封滅菌玻璃瓶后向實驗室移動。在實驗室，在滅菌狀態下，在class100的流罩中提取間充質干細胞。首先，向滅菌不銹鋼容器移動試樣。利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)數次清洗之后，脂肪組織試樣被截斷成2cm的長度并向50ml的試管移動，在這里，進一步清洗及通過70％的乙醇進行抗感染處理，通過添加抗生劑混合物(50IU/ml的青霉素、50μg/ml的鏈霉素(從Invitrogen購買))的磷酸緩沖鹽溶液清洗數次上述溶液，直到上述溶液變干凈。

實施例2-2：從人體脂肪組織分離間充質干細胞及培養

利用磷酸緩沖鹽溶液清洗已分離的脂肪組織后切細組織，利用添加有collagenase type1(1mg/ml)的達爾伯克改良伊格爾培養基在37℃的溫度下每隔10分鐘搖動一次并進行截斷(digestion)1小時。然后，利用磷酸緩沖鹽溶液清洗后在1000rpm下離心分離5分鐘。抽吸(suc tion)上層液，利用磷酸緩沖鹽溶液清洗剩在底面上的顆粒后，在1000rpm下離心分離5分鐘。利用網孔大小為100μm目(mesh)的過濾器進行過濾來去除殘渣(debris)后，利用磷酸緩沖鹽溶液清洗。

為了進行間充質細胞的分離/培養，將上述移植的組織浸漬于添加10％的胎牛血清(FBS，Hyclone)的5ml的達爾伯克改良伊格爾培養基F-12(Gibco)、10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的鏈霉素，由此在95％的氮和5％的二氧化碳細胞培養基中維持37℃的溫度，來維持低氧血癥(Hypoxic)狀態，以使除了干細胞以外的細胞致死，從而提高間充質干細胞的純度。每3日或4日更換上述培養基。通過光學顯微鏡監視源自移植的組織的細胞的成長(outgrowth)。為了追加的擴張及冷凍保管(利用達爾伯克改良伊格爾培養基/10％的胎牛血清)成長的細胞而對成長的細胞進行了胰蛋白酶處理(0.125％的胰蛋白酶/0.05％的乙二胺四乙酸(EDTA))

為了間充質干細胞的提取，細胞的顆粒再次懸浮及計數在達爾伯克改良伊格爾培養基F-12(Gibco)、10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的鏈霉素，并按1×10⁶細胞/皿的密度接種在10cm的組織培養皿。每3日或4日更換上述培養基。通過光學顯微鏡監視源自移植的組織的細胞的成長及克隆形成。如上所述，約為90％的細胞數(confluence)的細胞被亞培養(sub-culture)。

實驗例1：從脂肪來源間充質干細胞誘導多能干細胞

實驗例1-1：制備基于實施例1-1的腔昆布提取物濃度的來源于人體脂肪的間充質干細胞的多能干細胞

作為用于根據濟州腔昆布提取物的濃度從來源于人體脂肪的干細胞誘導多能干細胞的實驗，在對照組中將達爾伯克改良伊格爾培養基F-12(Gibco)、10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的鏈霉素作為間充質干細胞的基本培養基來使用，在實驗組中使用進行了三次繼代培養的來源于人體脂肪的間充質干細胞并向培養基添加了標準(Normal)、1μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1mg/ml濃度的在實施例1-1中制備的濟州腔昆布提取物和0.1v/v％的能量水(含有SiO₂、Al₂O₃、TiO₃、Fe₂O₃、CaO、Na₂O、K₂O、LiO的純化脫離子水，STCnara)(圖1)。在6孔板(dish)接種1×10⁴個分離來源于人體脂肪的間充質干細胞并清洗的單核細胞，并以維持37℃的溫度和5％的CO₂的方式培養了上述單核細胞。

結果，在實驗組中，僅當濟州腔昆布提取物的濃度為100至400μg/ml時，才能在10日之后，觀察到形成集落(圖2)。此時，顯微鏡的放大倍數為200倍。

實驗例1-2：制備基于實施例1-2的腔昆布提取物濃度的來源于人體脂肪的間充質干細胞的多能干細胞

以與實驗例1-1相同的方法來實驗，但使用了在實施例1-2中制備的濟州腔昆布提取物。結果，在實驗組中，僅當濟州腔昆布提取物的濃度為20至50μg/ml時，才能在10日之后，觀察到形成集落(圖3)。此時，顯微鏡的放大倍數為200倍。

實驗例1-3：通過本發明的方法誘導的多能干細胞的免疫化學染色分析

對于通過上述實驗例1及2的方法誘導的多能干細胞，使用與作為胚胎干細胞的特異性基因的OCT4、SOX2和作為蛋白質的階段特異性胚胎表面抗原-4(stage-specific embryonic antigen-4)的表達與否有關的抗體并使用免疫化學染色法來分析蛋白質的表達與否。

首先，在染色過程中，利用4％的多聚甲醛(Paraformaldehyde)固定細胞之后，利用磷酸緩沖鹽溶液進行清洗，并以1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液進行了阻塞(blocking)。處理對于OCT4、SOX2、階段特異性胚胎表面抗原-4的第一個抗體并在4℃的溫度下，反應18小時之后，利用磷酸緩沖鹽溶液進行清洗，且處理對于第一個抗體的附著有異硫氰酸熒光素(FITC，fluorescein isothiocyanate)的第二個抗體并在室溫條件下反應了的1小時。

在利用磷酸緩沖鹽溶液進行清洗之后，使用熒光顯微鏡(Fluorescence microscope)分析了表達與否，在圖4及圖5中示出其結果。BF意味著明視場(bright field)，第二張圖意味著對于各個蛋白質表達的染色結果，在第三張圖中，利用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行染色來表示細胞的核。

結果，利用乙醇提取的腔昆布提取物(實驗例1-1)和利用水提取的腔昆布提取物(實驗例1-2)均僅在作為多能干細胞特異性標記的OCT4、SOX2、階段特異性胚胎表面抗原-4的集落中產生陽性反應，從而確認到多能干細胞(圖4及圖5)。

實驗例1-4：多能干細胞基因分析比較

在顯微鏡下，使用200μl的吸液管僅摘除在上述實驗例1-1和1-2中制備的多能干細胞中的集落后，使用TRIzol試劑(Invitrogen公司制備)分離整個RNA。利用逆轉錄-聚合酶鏈反應((RT-PCR)合成互補DNA(cDNA)后，利用對OCT4、Sox-2、Nanog及作為對照基因的磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)基因具有特異性的引物進行聚合酶鏈反應。Nanog、OCT4、Sox-2為從胚胎干細胞所看到的特異性基因。利用瓊脂糖凝膠電泳分析聚合酶鏈反應產物，確認這些基因的表達的結果在圖6和圖7中示出。

結果，根據圖6和圖7，在未經過誘導過程的間充質干細胞(對照組，間充質干細胞)中，作為多能干細胞的特異性基因的OCT4、SOX2和Nanog的表達度低，相反，在通過本發明的方法誘導的多能干細胞(通過實驗例1-1(由EtOH EPN表示)及實驗例1-2(由Sonic EPN表示)來制備的多能干細胞中，這些特異性基因的表達度明顯高。可通過圖6及圖7的曲線圖來明確地確認作為干細胞基因的OCT4、SOX2和Nanog的表達程度。

以上，詳細記述了本發明的特定部分，但要明確，對于本發明所屬技術領域的普通技術人員而言，這些具體的記述僅為優選實例，本發明的范圍并不限定于此。因此，本發明的實質性范圍應根據所附的發明要求保護范圍和與該發明要求保護范圍等同的內容而定。