用于靶向癌癥和產生抗體的抗神經節苷脂化合物的制作方法

本申請說明書涉及作為抗腫瘤疫苗的神經節苷脂糖綴合物和其用途。

背景技術：

神經節苷脂是含神經氨酸的鞘糖脂，其在質膜的外部小葉中積聚。神經節苷脂，如GD2和GD3是普遍的腫瘤標記物。它們在成神經細胞瘤、黑素瘤、小細胞肺癌和神經膠質瘤(Hakomori,1996,Cancer Research,56:5309)以及乳腺癌干細胞(Battula et al.,2012,The Journal of clinical investigations,122:2066)中表達，但它們在正常細胞中不存在。因此，GD2和GD3已經被開發為腫瘤靶點，并且它們是有效的臨床靶點。局部治療可通過被動施用純化的抗GD2(Cheun et al.,1987,J Clin Oncol,5:1430)或者抗GD3單克隆抗體(mAbs)(Houghton et al.,1985,Proc Natl Acad Sci USA,82:1242)來實現。然而，被動免疫具有高的財務成本、顯著的副作用、有限的干預頻率和低的治療效果(Navid et al.,2010,Current Cancer Drug Targets,10:200)。

作為替代，許多團體追求主動免疫療法神經節苷脂(Astronomo and Burton,2010,Nat Rev Drug Discov,9:308)。然而，與神經節苷脂相關的嚴重困難包括免疫原性差、溶解性差和制劑差、有限使用和制備充分表征和同源的免疫原的困難、和具有結構高度相關的非腫瘤神經節苷脂交叉反應性風險的選擇性差的可能性。

例如，化學綴合到鑰孔戚血藍素(KLH)的GD2內酯是免疫原性的，并且可以誘導延遲小鼠腫瘤生長的抗體(Chapman et al.,2000,Clinical Cancer Research,6:4658)。由這種疫苗誘導的抗體通過補體依賴性細胞毒性(CDC)機制起作用(Kim et al.,2011,Cancer Immunology,Immunotherapy,60:621)。然而，KLH-神經節苷脂綴合產生化學異質產品(Danieshefsky and Allen,2000,Angew Chem Int Ed,39:836)，這是一個嚴重的缺點。其它神經節苷脂綴合物已顯示免疫原性差，并且通常引起低和短暫的抗神經節苷脂抗體應答(Ragupathi et al.,2000,International Journal of Cancer，85:659)。即使是最具免疫原性的神經節苷脂，GM2-KLH疫苗也沒有提供臨床益處(Kirkwood et al.,2001,Journal of Clinical Oncology,19:2370)，并且被中斷。另外的實驗方法包括GD2-肽模擬表位(Wondimu et al.,2008,Cancer Immunology,Immunotherapy,57:1079)、GD2-模仿肽(Bolesta et al.,2005,Cancer Research,65：3410)、和GD2模擬表位DNA疫苗(Zeytin et al.,2000,Cancer Gene Therapy,7:1426)，其可誘導對GD2的交叉反應性免疫。然而，在腫瘤治療范例中免疫應答沒有很有效地保護宿主(Bleeke et al.,2009,European Journal of Cancer,45:2915)。

因此，仍然需要提供利用神經節苷脂作為靶點的新治療方法。

技術實現要素：

根據一個方面，提供了下式的神經節苷脂碳水化合物：G-芳基-NH2，其中G是含有一個或多個唾液酸(例如n-乙酰神經氨酸)的寡糖，其中所述G通過C1異頭氧原子共價結合到芳基，并且G為免疫原性的，并且芳基是C6至C10芳基，任選地被取代。

本文所提供的神經節苷脂碳水化合物針對腫瘤具有免疫原性。更具體地，它提供了針對腫瘤具有免疫原性的神經節苷脂碳水化合物，用于預防或治療癌癥。

根據本說明書，還提供神經節苷脂碳水化合物多聚體，其包含共價結合到多聚體核心分子的如本文所述的至少一種或至少兩種碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物。

提供了特異性結合到如本文所限定的神經節苷脂碳水化合物或神經節苷脂碳水化合物多聚體的抗體。

還提供了包含如本文所限定的神經節苷脂碳水化合物或神經節苷脂碳水化合物多聚體的疫苗。

還提供了如本文所限定的神經節苷脂碳水化合物或神經節苷脂碳水化合物多聚體的用途，用于預防或治療癌癥。

還提供了如本文所限定的神經節苷脂碳水化合物或神經節苷脂碳水化合物多聚體在制備用于預防或治療癌癥的藥物中的用途。

還提供了在對其有需要的患者中預防或治療癌癥的方法，其包括對所述患者施用有效量的如本文所限定的神經節苷脂碳水化合物或神經節苷脂碳水化合物多聚體的步驟。

還提供了在對其有需要的患者中引發免疫原性應答的方法，其包括對所述患者施用有效量的如本文所限定的神經節苷脂碳水化合物或神經節苷脂碳水化合物多聚體的步驟。

還提供了包含有效量的如本文所限定的神經節苷脂碳水化合物多聚體和藥學上適用的載體或賦形劑的藥物組合物。

附圖說明

現在將參考附圖，其中：

圖1A顯示神經節苷脂GM1、GD3和GD2的結構；圖1B顯示如本文所公開的GD2和GD3類似物合成的示意圖；圖1C顯示如本文所公開的抗原合成的示意圖；

圖2A顯示GD2的氨基苯基醚類似物(AP-GD2)的質譜；圖2B顯示重水中的GD2的氨基苯基醚類似物(AP-GD2)的H-NMR譜；圖2C顯示重水中的四-GD2樹狀大分子的H-NMR譜；

圖3A顯示表明IgG類的抗GD2反應性抗體存在的代表性FACScan數據；圖3B顯示使用抗-小鼠IgG第二試劑研究的測試或對照血清的連續稀釋；圖3C顯示表明每輪免疫后IgG和IgM同種型增加的血清分型；圖3D顯示在用指定抗體培養的完全培養基中指數增長的EL4-GD2⁺細胞和24小時后MTT量化的它們的存活/代謝；

圖4A顯示由³H-胸苷摻入試驗評估的T細胞增殖，其中與從接種的或從初次接受試驗的小鼠純化的T細胞以1:10的比例培養腫瘤細胞；圖4B顯示用臺盼藍排除(Trypan Blue exclusion)測量的GD2依賴性T細胞增殖；

圖5A顯示腹腔內接種的小鼠的測量的腫瘤體積；圖5B顯示針對免疫的與對照的小鼠測量的平均腫瘤體積；圖5C顯示利用四-GD2在腹腔內接種的小鼠中測量的腫瘤體積；圖5D顯示免疫的與對照的小鼠平均腫瘤體積；圖5E顯示過繼轉移的治療效果；圖5F顯示淋巴結轉移的定量；

圖6顯示來自2組初次接受試驗的荷瘤小鼠(對照或接種的)的純化的T細胞，和通過FACScan定量的細胞的CD4/CD8分布圖；

圖7是顯示IgG亞類的抗GD3反應性抗體的血清的代表性ELISA數據；

圖8和9表示用四-GD3接種的結果；和

圖10顯示在使用GD3疫苗接種后轉移結節的計數。

具體實施方式

本公開內容涉及由以下組成的神經節苷脂碳水化合物：

本公開內容具體提供由以下組成的神經節苷脂碳水化合物：

如本文所用，G指的是僅包含對應于各自神經節苷脂的寡糖和唾液酸(例如，n-乙酰神經氨酸，NANA)的各自神經節苷脂(如GD2、GD3、GM2和GT1b)的部分。換言之，G指的是相應的神經節苷脂的寡糖和唾液酸，不包括在本文被氨基-芳基殘基(如氨基-苯基)取代的神經節苷脂的神經酰胺部分。本文所用的G的實例包括GD3和GD2的殘基，諸如

如本文所用的術語“芳基”，被理解為6至10元的芳族基團，例如苯基或萘基，優選苯基。芳族環可在一個或多個環位置處，優選在不存在取代基處，被取代，并且氨基優選相對于糖部分在苯基的對位。優選地，因此“-芳基-NH₂”是4-氨基苯基。

關于芳基的術語“任選地取代”指用烷基、芳基、或鹵素中的一種或多種在任何可用的位置或多個位置任選地取代。優選地，沒有取代基。

本公開內容提供了包含共價結合到多聚體核心分子的至少一種或至少兩種碳水化合物神經節苷脂類似物的神經節苷脂碳水化合物多聚體。

在一個實施方式中，碳水化合物神經節苷脂類似物是GD2、GD3、GM2和GT1b中的至少一種的類似物。

在一個實施方式中，碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物多聚體包含至少一種GD2碳水化合物神經節苷脂類似物、或至少一種GD3碳水化合物神經節苷脂類似物。

在一個實施方式中，碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物多聚體是碳水化合物神經節苷脂類似物的四聚體。在一個實施方式中，碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物多聚體可用于預防或治療癌癥。在一個實施方式中，碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物多聚體可用于治療癌癥。在一個實施方式中，癌癥是神經節苷脂陽性癌癥。在另一個實施方式中，癌癥是成神經細胞瘤、黑素瘤、或神經膠質瘤。在一個實施方式中，癌癥是乳腺癌或小細胞肺癌。

在一個實施方式中，提供特異性結合如本文限定的碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物多聚體的抗體。在一個實施方式中，抗體是單克隆抗體、多克隆抗體或人源化抗體。在一個實施方式中，抗體用于預防或治療癌癥。在一個實施方式中，癌癥是神經節苷脂陽性癌癥。在一個實施方式中，癌癥是成神經細胞瘤、黑素瘤、或神經膠質瘤。在一個實施方式中，癌癥是乳腺癌或小細胞肺癌。在一個實施方式中，癌癥是乳腺癌或小細胞肺癌。

在一個實施方式中，提供了包含如本文限定的碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物多聚體和載體的疫苗。在一個實施方式中，疫苗用于預防或治療癌癥。在一個實施方式中，癌癥是神經節苷脂陽性癌癥。在一個實施方式中，癌癥是成神經細胞瘤、黑素瘤、或神經膠質瘤。在一個實施方式中，癌癥是乳腺癌或小細胞肺癌。

在一個實施方式中，用于本文限定的方法或用途的碳水化合物神經節苷脂類似物或神經節苷脂碳水化合物多聚體被配制用于注射。在一個實施方式中，疫苗被配制用于經皮給藥或腸胃外給藥。在一個實施方式中，腸胃外給藥是肌肉內給藥、皮下給藥或靜脈內給藥。

在一個具體的實施方式中，免疫原性的GD2糖綴合物在此公開，其被用作抗腫瘤疫苗。

本文公開了綴合以形成樹狀大分子(例如四聚體，以下稱為“四-GD2”或“四-GD3”)的GD2和GD3碳水化合物的水溶性類似物的設計和特性。

例如，四聚體神經節苷脂碳水化合物保存天然存在的GD2或GD3的天然結構特征，但具有免疫原性并且引起體內細胞毒性抗神經節苷脂體液和細胞應答。例如，四-GD2在預防和治療范例中作為GD2癌癥疫苗是有效的。提供了有效的抗腫瘤疫苗，靶向細胞表面碳水化合物，其迅速引起在治療范例中具有保護性的體液和細胞免疫應答。

神經節苷脂積聚在細胞膜的外部小葉，神經酰胺和脂質是嵌入的并且碳水化合物頭部是暴露的。這應該能被免疫系統識別，因為復雜的神經節苷脂是新抗原并被限定為腫瘤標記物。此外，甚至抗原神經節苷脂也是差的免疫原。免疫系統可將碳水化合物識別為“自身”而不做出應答或者它可產生交叉反應性的病理反應(例如格-巴二氏綜合征是由于抗GM1抗體)。

產生具有免疫原性并且可用于產生針對腫瘤的選擇性免疫的GD2和GD3的合成的碳水化合物類似物。

據信，G的類似物(如GD2、GD3、GM2和GT1b中的至少一種的類似物)可以是多聚體、即二聚體、三聚體、四聚體或適于允許適當的空間定位的任何其它形式。

據信，尤其GD2和GD3的類似物可以是多聚體，即二聚體、三聚體、四聚體或適于允許GD2或GD3的適當空間定位的任何其它形式。本文包括如本文所述的碳水化合物神經節苷脂類似物的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16多聚體。

以下示意圖1顯示處于四聚體形式的GD2和GD3免疫原性的合成碳水化合物類似物。

類似物基本上包括一個中心多聚體(或如上所示的四聚體)核心，其允許共價結合到間隔基(spacer)，間隔基反過來也共價結合到所需的GD2或GD3。該間隔基的典型例子是-(C＝X)-，其中X是N或X(如-(C＝S)-或-(C＝O)-)。間隔基可通過使用異氰酸酯或異硫氰酸酯化學作用來引入。圖1c顯示具體的例子，但是該化學作用將適用于以上公開的GD2/GD3氨基芳基化合物。

優選地，中央核心包括乙二胺殘基，通常如示意圖2中所述，其上連接許多末端(即，伯)氨基。

該核心的實例可以是PAMAM化合物，其中許多是商業上可獲得的(參見www.sigmaaldrich.com上的Aldrich Catalog)。優選地，中央多聚體核心具有許多末端(即，伯)氨基。PAMAM化合物的實例包括0.0代PAMAM。

PAMAM化合物的較高代包括PAMAM，其上的末端-NH₂進一步(部分或完全)由殘基官能化：

這樣的較高代PAMAM的部分表示如下：

其中剩余的“臂”(顯示波浪線)也可任選地具有酰氨基胺(amido amine)的殘基，以提供多達8個可進一步擴展的多聚體。

當中央核心是以上列出的0.0代時，四聚體中G(如GD2和GD3)的免疫原性的合成的碳水化合物類似物的實例可通過以下說明：

其中G是以上所限定的，或優選地

X是O或S，優選地X是S。

如Gilbert et al.,2002,J Bio Chem,277:327所述，可合成GD2或GD3衍生物，同時改變Tong et al.,2010,Chem Bio,17:183的方法以使用具有可用于將GD2或GD3共價結合到中央多聚體核心的氨基的適當官能化的β-D-乳糖吡喃糖苷。例如，官能化的β-D-乳糖吡喃糖苷可以是C1-β-D-乳糖吡喃糖苷氨基芳基衍生物，或優選氨基苯基-β-D-乳糖吡喃糖苷或更優選p-氨基苯基-β-D-乳糖吡喃糖苷。

官能化的β-D-乳糖吡喃糖苷可進一步衍生，以便中央多聚體(或如上所示的四聚體)核心可共價結合。官能化β-D-乳糖吡喃糖苷可與合適的試劑反應，以提供活化的羰基殘基。例如，C1-氨基芳基衍生物、或優選氨基苯基-β-D-乳糖吡喃糖苷或更優選p-氨基苯基-β-D-乳糖吡喃糖苷可以與光氣、雙光氣、三光氣、硫光氣、羰基二咪唑、二琥珀酰亞胺基碳酸酯、或其它合適的試劑反應以提供相應的異氰酸基、異硫氰酸基、羰基咪唑基或琥珀酰亞胺基羰基衍生物。

中央多聚體核心然后可與具有上述活化的羰基殘基的官能化β-D-乳糖吡喃糖苷反應以提供所需的免疫原性分子。

作為替代的合成方法，中央多聚體核心(如PAMAM)可首先與合適的試劑反應，以提供如上所述活化的羰基殘基。然后可添加含有氨基的官能化的β-D-乳糖吡喃糖苷，以提供所需的免疫原性分子。

如果進一步的另外的治療劑是需要的或期望的，那么比率將容易被調節，這對于普通技術人員來說將是清楚的。應當理解的是，本文所述的組合的范圍沒有被具體地限制，但原則上包括用于預防和治療癌癥的任何治療劑。

將可以理解的是，用于治療所需要的本發明的化合物的量將不僅隨著所選擇的特定化合物變化，而且隨著給藥途徑、需要治療的狀況的性質和患者的年齡和狀況變化，并且最終將由主治醫生決定。

所需的劑量可以方便地呈現為單一劑量或作為分次劑量以適當的間隔施用，例如每天二、三、四或更多次劑量。

藥物組合物包括但不限于那些適合于經皮、或腸胃外(包括肌內、皮下和靜脈內)給藥的組合物。

用于制備藥物組合物的方法可包括將本文所限定的化合物和藥學上可接受的賦形劑相結合的步驟。

如本文所限定的化合物和組合也可配制用于腸胃外給藥(例如通過注射，例如推注(bolus injection)或連續輸注)并且可以安瓿、預填充注射器、小體積輸注或具有添加的防腐劑的多劑量容器中的單位劑量形式呈現。組合物可采取如懸浮液、溶液或油性或水性載體中的乳液的形式，并且可含有配制劑如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。可選地，活性成分可以是，通過無菌固體的無菌分離或通過從溶液凍干而獲得的粉末形式，以用于在使用前利用合適的載體，例如無菌水或鹽水來構成(constitution)。

具體實施方式如下所述，之后描述實施例。

公開了氨基苯基醚-GD2類似物(本文中的AP-GD2)，它具有正確的GD2碳水化合物結構，但是氨基苯基取代神經酰胺和脂質(參照圖1B)。該類似物是水溶性的。在AP-GD2中，苯基和第一糖之間的鍵優選處于β構型，β構型是天然神經節苷脂中神經酰胺和第一糖之間的構型。該鍵對于顯示遍及整個碳水化合物的適當和同類的結構是至關重要的。預期質量和構型通過質譜法(圖2A)和NMR光譜學(圖2B)分別驗證。

將AP-GD2轉化成其相應的異硫氰酸苯基類似物，并且將該中間體偶聯至四價PAMAM G0連接體樹狀核心的末端游離胺(圖1C)。AP-GD2和PAMAM G0連接體之間的硫脲橋的形成通過出現在HMBC(NHC(S)NHPh)譜中在178ppm處的碳化學位移驗證。四聚體產物的形成通過1D-¹H-NMR驗證。1D-¹H-NMR譜顯示所有糖單元的單一信號模式，并指出酰胺NHs、NHC(S)NHPh、H-鄰、H-間、NHAc/CH3/H_ax或H_eq的40:36:8的比率，表明GD2樹狀大分子確實是四價的(圖2C)。

設計四-GD2抗原以用作腫瘤治療研究中的免疫原。作為潛在免疫原的四-GD2的設計的基本原理基于以下概念。首先，四-GD2的呈現可能會更接近地模擬膜筏(membrane rafts)中正常聚集的GD2的寡聚展示。其次，糖AP-GD2類似物可容易地在溫和條件下在室溫下綴合至PAMAM連接體。第三，化學-酶法合成保證糖苷鍵的合適的構型，從而保持整個碳水化合物的構象。第四，抗原將是同質的并且被充分化學表征。第五，所得到的產物將是水溶性的和穩定的。所有這些特征是疫苗所需的，并且可轉變成在此公開的AP-GD3。

利用四-GD2對小鼠進行免疫多達四次。每次免疫四天后收集血清，并針對抗神經節苷脂抗體的存在測試樣品。在25只小鼠中的22只(88％)中利用四-GD2進行的免疫產生針對腫瘤標記物GD2和GD3神經節苷脂的高滴度和選擇性抗血清。

FACScan測試的數據表明，免疫的小鼠血清具有與腫瘤細胞中細胞表面GD2和GD3選擇性反應的抗體(參見圖3A和表1)。其血清含有IgG和IgM同種型抗體(基于所使用的同種型特異的第二試劑)。血清結合EL4-GD2⁺和/或EL4-GD3⁺細胞。陰性對照正常小鼠血清預免疫(NMS)無反應性。陽性對照mAbs顯示EL4-GD2⁺細胞表達GD2而不是GD3，并且EL4-GD3⁺細胞表達GD3而不是GD2。在細胞對照中，血清并不結合不表達GD2或GD3但表達許多其它神經節苷脂如GM1的Jurkat細胞。

表1

用GD2四聚體免疫的小鼠血清的抗神經節苷脂反應性

針對與固定化神經節苷脂的直接結合，血清還通過ELISA進行測試。將神經節苷脂GD2、GD3、或對照固定在板上，并且測試試驗和對照免疫前血清的指示的稀釋液。通過選擇性結合GD2的疫苗接種產生抗體(參照圖3B)。一次免疫足以引起循環抗GD2IgG的增加，比背景多約2倍，并在增強之后存在高于背景的約3倍的增加(圖3C)。抗體也結合GD3，但不結合GM1。檢測抗GD2IgG和抗GD2IgM同種型。每次增強后IgG同種型增加，提示B細胞成熟和類型轉換(圖3C)。這些ELISA數據與通過FACScan獲得的結果一致。

利用四-GD2接種的小鼠的抗體殺死培養物中的EL4-GD2⁺細胞(圖3D)。在補體不存在的情況下EL4-GD2⁺細胞被免疫血清殺死——已經報道的一些抗GD2mAbs的效果(Yoshida et al.,2001,Cancer Research,61:4244)(例如，mAb 3F8殺死細胞，但mAb ME361沒有)。此外，EL4-GD2⁺細胞的殺傷通過對活體染料臺盼藍染色的細胞計數和評估其形態學來證實。

總之，這些數據證實作為免疫原的四-GD2產生細胞毒性體液免疫力并使其成熟。

已經證明，糖肽疫苗可通過結合組織相容性II類(MHC II)激活適應性免疫系統(Avci et al.,2011,Nature Medicine,17:1602)。這提示，T細胞介導的免疫還可被四-GD2激活。因此，對測量³H-胸苷摻入的混合淋巴細胞反應(MLR)中的原代T細胞進行試驗。作為T細胞活化的靶細胞刺激物，使用絲裂霉素(mytomicin)處理過的EL4-GD2⁺，并且Jurkat細胞(GD2^-)被用作陰性對照(圖4A)。絲裂霉素處理過的EL4-GD2⁺或Jurkat細胞沒有摻入³H胸苷(分別為188±4cpm和107±5cpm)，因此它們只充當刺激物。

用四-GD2接種兩次的小鼠的T細胞在用EL4-GD2⁺細胞攻擊時強大地增殖，但在用Jurkat細胞攻擊時，它們沒有增殖。在細胞對照中，來自未接種小鼠的T細胞在用EL4-GD2⁺或Jurkat細胞攻擊時沒有增殖。在陽性對照中，ConA處理在類似程度上刺激了對照或接種的小鼠的T細胞的增殖(分別為21,457±504cpm和19,834±309cpm)。類似的數據通過臺盼藍排除法對各組中增殖T細胞的數目進行計數的相關測試獲得(圖4B)。在這些試驗中，四-GD2接種的小鼠的40,000個應答T細胞用作為刺激物的活細胞Jurkat或EL4接種。7天的體外培養之后，所有的EL4靶細胞死亡，而Jurkat細胞存活并繁殖。

總之，這些數據證實作為免疫原的四-GD2產生細胞免疫力。

在腫瘤預防的范例中，免疫活性的C57/BI6小鼠間隔一周腹膜內免疫兩次，隨后皮下植入同源的EL4-GD2⁺細胞，其是非常攻擊性和高度轉移性的。EL4細胞是同源的，并且在這些小鼠中生長和轉移非常快速。在測量的所有天(腫瘤移植后11、14、16)，免疫的小鼠(5≤n≤9)具有比對照小鼠顯著較小尺寸的原發腫瘤(圖5A)。腫瘤預防的疫苗實驗獨立重現三次(總n＝22免疫的與n＝22對照小鼠)。為了比較所有三個獨立的實驗，在第16天每個實驗的對照小鼠的平均腫瘤體積被標準化為100％。使用此標準，免疫小鼠中的總腫瘤體積降低約57％(圖5B)。

在腫瘤治療的范例中，首先用EL4-GD2⁺細胞植入小鼠，并且當腫瘤是可見/可觸及時，小鼠用四-GD2或對照載體免疫兩次。在這個更臨床相關的范例中，在測量的所有天，免疫的小鼠(4≤n≤6)與對照小鼠相比已顯著延遲原發腫瘤生長(圖5C)。18天后，所有的對照小鼠發展了平均約6,000mm³的原發腫瘤，和廣泛的淋巴結轉移。相比之下，免疫的小鼠具有約2,300mm³的原發腫瘤。

腫瘤治療的疫苗數據在兩個獨立的實驗(N＝13免疫的與n＝18對照小鼠)中再現。為了比較所有實驗，在第18天每個實驗的對照小鼠的平均腫瘤體積被標準化為100％。使用此標準，免疫小鼠中的總腫瘤體積降低約51％(圖5D)。

具有皮下腫瘤的小鼠通過腹腔注射接收純化自四-GD2免疫的供體小鼠的4×10⁶T細胞。在測量的所有天，過繼轉移的小鼠(n＝6)相比對照未處理小鼠(n＝6)已顯著延遲原發腫瘤生長(圖5E)。腫瘤生長14天后，對照組發展了平均約1,200mm³的原發腫瘤。相比之下，過繼轉移組具有約500mm³的原發腫瘤。

值得注意的是，過繼轉移組沒有轉移至淋巴結或胸腺的證據，淋巴結或胸腺是觀察EL4腫瘤轉移的主要位點的器官。EL4腫瘤轉移引起組織擴大，和可量化的重量的相應增加。荷瘤小鼠(n＝6)比不帶腫瘤的初次接受試驗的小鼠具有更大的淋巴結，其尺寸增加約10倍。荷瘤但接受T細胞過繼轉移的小鼠(n＝6)具有較小的淋巴結，其可比得上正常淋巴結(圖5F)。

接種后激活的T細胞關于其CD4和CD8表型被進一步表征。T細胞分離自荷瘤接種的小鼠或對照小鼠，并且將細胞在具有固定在塑料上的GD2的平皿中培養。接種小鼠的T細胞在GD2包被的平皿中強大增殖。相比之下，對照小鼠的T細胞沒有在GD2包被的平皿上增殖。雖然所有的小鼠都帶有腫瘤并且暴露于GD2，但是僅接種小鼠可以對這種抗原作出應答。表征培養物的FACScan試驗顯示，增殖細胞的表型主要是CD8⁺。由于CD8亞群的擴增，這些細胞中的CD4/CD8比率改變，然而對照小鼠的T細胞保持正常CD4/CD8比率(圖6)。

這些數據表明，接種后激活的T細胞可在缺少抗原呈遞細胞的情況下對固定化(多價)抗原進行應答。

腫瘤浸潤淋巴細胞的存在通過免疫染色從原發腫瘤制備的冷凍切片來驗證。EL4腫瘤是“雙陰性”T細胞，并且不與抗CD4或抗CD8抗體染色。相比沒有接受過繼轉移的荷瘤小鼠，在接受免疫小鼠的T細胞的過繼轉移的小鼠中，原發腫瘤中存在明顯較高數量的浸潤的CD8⁺細胞。抗CD4抗體在兩個組中檢測到浸潤CD4⁺細胞。

總之，該數據顯示疫苗接種足以處理真實治療范例——其中在腫瘤形成后給予疫苗——中的原發腫瘤生長和腫瘤轉移。

一種新的四價GD2碳水化合物樹狀大分子已發展為有效的碳水化合物免疫原和治療性癌癥疫苗。合成免疫原的生物物理表征顯示它是同質的四聚體，其維持所需的β-鍵。寡聚碳水化合物結構對免疫系統的呈現可通過模擬腫瘤膜中的筏式GD2刺激更真正的和細胞毒性抗腫瘤應答。體內和體外生物學研究顯示疫苗誘導抗GD2細胞毒性抗體和細胞毒性細胞免疫。由疫苗引起的免疫可延緩已形成的腫瘤生長和轉移。本文公開的體內研究證實，神經節苷脂疫苗不僅可以阻止腫瘤的生長，還可抑制已形成的腫瘤生長。

從針對本文所描述的四價GD2碳水化合物樹狀大分子所生成的數據，靶向碳水化合物的其它癌癥疫苗的發展，和適于其它腫瘤相關的神經節苷脂如GD3涵蓋在本文。從氨基苯基醚-GD3類似物制備的四聚體GD3碳水化合物在本文公開(參見圖1B)，與保存天然存在的GD3天然結構特征的AP-GD2類似，其可預測地具有免疫原性并且會引起體內細胞毒性抗神經節苷脂體液和細胞應答。

利用與AP-GD2所述的相同的合成策略，產生GD3樹狀大分子(四-GD3)類似物并且兩輪免疫后，檢測到抗GD3抗體的高滴度。從圖7可看出，檢測到通過接種四-GD3引發的體液免疫。

新的GD3疫苗被評價為體內抗癌劑并且確定在測量的所有天，免疫小鼠具有比對照小鼠明顯較小尺寸的原發腫瘤(圖8)，并且轉移實際上不存在于淋巴結(圖9)和肺(圖10)。GD3疫苗減少黑素瘤肺轉移(圖10)。因此，新的四價GD3碳水化合物樹狀大分子已發展為有效的碳水化合物免疫原和治療性癌癥疫苗。

通過參照以下實施例，本公開內容將被更容易地理解，所給出的實施例用于闡述實施方式而不是限制其范圍。

實施例I

合成AP-GD2和四-GD2樹狀大分子

碳水化合物如以下所述(Gilbert et al.,2002,J Biol Chem,277:327)通過改變苯硫基GD2的方法(Tong et al.,2010,Chem Biol,17:183)來合成，其中最初報導的苯硫基類似物由p-氨基苯基-β-D-乳糖吡喃糖苷(AP-Lac)(Toronto Research Chemcals)取代，用于隨后綴合樹狀大分子(見下文)。AP-GD2是水溶性的(>20mg/ml)，并通過尺寸排阻(Superdex 30 16mm×85cm柱，GE Health Care)純化至>99％純度。AP-GD2的測量分子量為1218g/mol，與預期值對應。結構通過1D和2D NMR光譜學和質譜(EI-MS)驗證(參見圖2A和B)。AP-GD2的化學酶法合成具有約90％純材料的最終產率。

將硫光氣(2μΙ)加入到80％乙醇(300μΙ)的AP-GD2(2mg)攪拌溶液，并允許將該混合物在室溫下靜置3小時，那時薄層色譜法(乙酸乙酯-甲醇，4:1)顯示所有的起始材料已經反應并且單一產品已經形成。濃縮至幾乎干燥得到固體，向其中添加水。過濾并用水洗滌產品，得到異硫氰酸苯基GD2溶液，其被冷凍干燥成白色粉末(1.8mg，90％產率)。將來自PAMAM G0(Dendritech,Inc)的甲醇溶液的揮發物在減壓下蒸發，將所得殘余物溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中。將異硫氰酸苯基GD2(1.8mg)在DMF(110μl)中的溶液逐滴加入到N,N-二異丙基乙胺(0.5μΙ)和PAMAM G0(0.854μg/μl的2μΙ)的攪拌的DMF溶液(100μl)。將反應在室溫下攪拌20小時，直到用TLC檢測無起始材料。用3ml水稀釋該反應混合物，針對水進行透析(截留分子量2kDa，Spectrum Laboratories Inc)。將所得溶液冷凍干燥，得到基于四價PAMAM的GD2，其為80％產率的白色粉末(1.34mg)。基于四價PAMAM的GD2由1D和2D NMR光譜學驗證。從ATCC獲得小鼠淋巴瘤EL4-GD2⁺(野生型EL4細胞)和Jurkat白血病細胞。通過使用抗GD2mAbs陰性選擇EL4-GD2⁺，隨后通過有限稀釋亞克隆來產生EL4-GD3⁺細胞。EL4-GD3⁺細胞是穩定的，并具有與EL4-GD2⁺細胞相同的體外生長特性和動力學。所有細胞在37℃下5％CO₂加濕的氣氛中在補充有5％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes和青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養基(Wisent INC)中生長。流式細胞術顯示，所有細胞系表達同等水平的細胞表面GM1。流式細胞術和神經節苷脂提取物的薄層色譜證實，EL4-GD2⁺細胞表達GD2但不表達GD3，EL4-GD3⁺細胞表達GD3但不表達GD2，并且Jurkat細胞不表達GD2或GD3。

實施例Ⅱ

四-GD2的體內表征

用于血清FACS和ELISA表征的免疫

將PBS中的四-GD2(50μg)腹膜內施用給C57/BI6小鼠。10天后，用PBS中的四-GD2腹膜內(25μg)和皮下(25μg)再免疫小鼠。四天后，收集血液樣品用于分析。

FACSan：2×10⁵的EL4-GD2⁺細胞、EL4-GD3⁺細胞、和Jurkat細胞用FACS緩沖液(PBS、0.5％BSA、0.05％NaN3)洗滌，并與2μΙ小鼠抗血清(1:50稀釋)或陽性對照抗GD2mAb(13nM)或抗GD3mAb(13nM)在冰上溫育20分鐘。細胞用冰冷的FACS緩沖液洗滌2次，并在冰上與FITC結合的抗小鼠IgG或FITC結合的抗小鼠IgM(Sigma)溫育20分鐘。細胞用FACS緩沖液洗滌，并在流式細胞儀(Becton-Dickinson)中現研究，并使用CellQuest軟件分析數據。小鼠IgG或IgM和正常小鼠血清用作陰性對照抗體。Jurkat細胞用作陰性對照細胞。

直接結合ELISA：神經節苷脂(Advanced Immunochemical Inc)被固定到聚苯乙烯Corning Strip Well 96孔板上(10ng/孔)(Fisher Scientific)。然后用含有0.5％牛血清白蛋白(PBS-0.5％BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水“封鎖”孔一小時。將孔與包括測試血清、對照預出血(pre-bleed)小鼠血清、小鼠IgG(Sigma)的初級抗體，或特異性抗神經節苷脂的單克隆抗體溫育2小時。將板用PBS-0.5％BSA，之后是對小鼠IgG同種型、或小鼠IgM同種型具有特異性的辣根過氧化物酶(HRP)結合的抗小鼠抗體(Sigma)洗滌三次。用PBS-0.5％BSA洗滌三次并且用PBS洗滌兩次后，添加比色底物TMB單溶液(Promega)，并將該反應用0.5N H₂SO₄終止。將板在450nm處讀數(Benchmark Plus，Bio-Rad)(31)。

血清分型：每輪免疫后利用毛細管血液收集系統(Microvette，Sardstedt)收集血液并在室溫下以10000×g離心5分鐘以用于血清分離。然后使用小鼠亞分型試劑盒(Calbiochem，cat#386445)遵循制造商的說明書對存在于血清中的Ig進行分型。實驗針對每種血清的三份進行4次。

通過MTT測試評估的細胞毒性

EL4-GD2⁺細胞(5,000/孔，在96孔板中，Corning)在補充有指示試劑的常規培養基中培養。24小時后細胞的存活/代謝概況用四唑鹽試劑(MTT，Sigma)和UV吸收定量。試驗一式四份各進行5次。試驗試劑包括陽性對照抗GD2mAbs(7nM最終濃度)、陰性對照正常小鼠IgG(7nM最終濃度)。從初次接受試驗的小鼠(陰性對照)、或腹膜內接種兩次的試驗小鼠收集血清。在這些實驗中，接種是在第3天和第10天進行，血清在第13天收集。血清采集的時間遵循腫瘤治療范例的時間線(見下文)。半純化血清并且施加約50μg/孔的血清抗體。血清抗體的小部分將是抗神經節苷脂抗體，然而mAbs對照含有100％抗神經節苷脂IgG。

由³H-胸苷摻入法評估的混合淋巴細胞反應(MLR)

用25μg/ml絲裂霉素(Sigma)處理EL4-GD2⁺細胞和對照Jurkat細胞1小時以阻止其增殖。將細胞用培養基洗滌三次以除去絲裂霉素后，將它們以2×10⁵細胞/孔鋪板在96孔板中。從兩次免疫(如上)和注射載體的對照小鼠獲得脾細胞的單細胞懸浮液。按照EASYSEPTM磁體(Stem Cell Tech)的方案分離細胞。從每只小鼠脾臟得到類似量的T細胞(>95％純度，數據未顯示)。將T細胞與絲裂霉素處理過的EL4或Jurkat細胞以10:1的比率鋪板。作為對照，使用單獨的T細胞(沒有刺激腫瘤細胞)或伴刀豆球蛋白A處理過的T細胞的培養物。培養5天后，加入0.1μCi/孔³H-胸苷(Sigma-Aldrich公司)。摻入DNA的³H-胸苷通過液體閃爍計數，并且數據報告為平均值cpm±sd。

實施例Ⅲ

腫瘤預防研究

用于腫瘤預防研究的免疫

給C57BL/6小鼠腹膜內接種四次，每次每隔一周(每次50μg)。對照小鼠僅接受載體注射。第四次接種的一周后，皮下注射5×10⁵EL4-GD2⁺。腫瘤攻擊后十天，在腫瘤植入后的指定時間測量腫瘤。

用于腫瘤治療研究的免疫

用5×10⁵EL4-GD2⁺細胞在左側皮下注射C57BL/6小鼠。三天后，當腫瘤是可見/可觸及時，將小鼠隨機化并且用載體對照或四-GD2-樹狀大分子(PBS中50μg)在右側腹膜內接種兩次。在腫瘤植入后的指定時間測量腫瘤。

過繼T細胞轉移治療研究

給C57BL/6小鼠用50μg四-GD2腹膜內接種兩次(相隔一周)。第二次免疫后七天，使用EasySep陰性選擇小鼠T細胞富集試劑盒(Stemcell Tech)從脾和淋巴結分離T細胞。將約4×10⁶T細胞腹膜內注射給C57BL/6小鼠，過繼轉移之前3天C57BL/6小鼠已被皮下注射2.5×10⁵EL4-GD2⁺細胞。在指定時間測量腫瘤并在腫瘤植入后14天將小鼠安樂死，以解剖同側腹股溝和腋窩淋巴結并評估轉移。

腫瘤生長的評估

用數字游標卡尺測量原發腫瘤，并通過下面的等式分析數據：V(mm³)＝0.5×寬度×(長度)²。安樂死后，將小鼠解剖并且顯微鏡檢查以獲得向淋巴結和胸腺(已知EL4細胞回家的器官)轉移的證據。

通過雙尾學生t檢驗分析兩組的腫瘤生長的差異；統計學意義在P<0.05(*)和P<0.01(**)。在別處，單向ANOVA與Tukey-Kramer多重比較檢驗比較了五個不同的組。結果之間的差異被認為在P<0.05(*)和P<0.01(**)具有統計學意義。

實施例Ⅳ

四-GD3的體內表征

安全性。接種的小鼠沒有顯示出可從已知的副作用預測的不利影響的任何跡象。測量的所有端點都是陰性的，包括使用GD2和GD3抗原的形式的臨床試驗中報告有問題的那些端點(痛覺過敏，行為、活動、和學習/記憶的改變)。過度免疫的小鼠沒有生成針對正常神經節苷脂的交叉反應性免疫，并且沒有改變血液學分布、肝臟或腎臟酶分布。

利用實施例I中所述的相同的合成策略，產生GD3樹狀大分子(四-GD3)類似物。兩輪免疫后，檢測到高滴度的抗GD3抗體而不是抗GM1Abs。安全性評價，如上所述，沒有發現問題。

圖7顯示了用四-GD3接種引起體液免疫。血清的代表性ELISA數據顯示IgG亞類的抗GD3-反應性抗體。陰性對照是正常小鼠的接種前血清和小鼠Ig(Sigma)。結合對GD3是選擇性的，然而GM1ELISA板是陰性的(未示出)。顯示的數據為n＝8種個體樣品平均值±sem。

新GD3疫苗被評價為體內抗癌劑。使用表達高水平GD3的EL4-GD3+。在預防的范例中，在非常攻擊性的同源EL4-GD3+植入前對小鼠進行兩次免疫。在臨床相關腫瘤治療模型中，進行從接種的供體小鼠到攜帶形成的皮下腫瘤的小鼠的T細胞過繼轉移。在兩種范例中，在測量的所有天，免疫過的小鼠具有比對照小鼠明顯較小尺寸的原發腫瘤(圖8)，并且轉移實際上不存在于淋巴結(圖9)和肺(圖10)。

圖8顯示用四-GD3接種的結果保護不受GD3+腫瘤攻擊。在EL4-GD3+細胞皮下腫瘤植入前用四-GD3腹膜內接種小鼠(2x，間隔1周，每次10μg/小鼠，無佐劑)。平均原發腫瘤體積±sd。

圖9顯示用四-GD3接種的結果保護不受GD3+腫瘤攻擊。在EL4-GD3+細胞皮下腫瘤植入前用四-GD3腹膜內接種小鼠(2x，間隔1周，每次10μg/小鼠，無佐劑)。平均淋巴結體積±sd(指示轉移，通過檢測淋巴結中的EL4細胞而測量)，每組n＝8。淋巴結顯示為實施。

圖10顯示GD3疫苗降低黑素瘤肺轉移的觀察。將5×10⁵B16-GD3黑素瘤細胞注射到C57BL/6小鼠的尾靜脈中。三天后，將小鼠隨機化并且腹膜內接種兩次。14天后處死小鼠。對具有轉移性結節黑斑的肺進行定量(腫瘤含有黑色素并且可以很容易看到)。

雖然本發明已經結合其具體實施方式進行了描述，但是可以理解，其能夠進一步修改，并且本申請意欲涵蓋本發明的任何變化、應用、或修改，其屬于本發明所屬領域內的已知或慣常做法，并且可應用于上文所述的基本特征，并且在以下所附權利要求的范圍內。