本發(fā)明提供一種聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中富集分離藻藍(lán)蛋白方法。屬于生化分離工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
螺旋藻藻藍(lán)蛋白存在于螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍(lán)藻所特有的一種超分子捕光色素復(fù)合體。藻藍(lán)蛋白色澤呈明亮的藍(lán)色，顏色鮮艷，是食品、高級(jí)眼影、唇膏的首選純天然色素。藻藍(lán)蛋白還可以調(diào)節(jié)和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗氧化、抗炎癥作用，調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能。高純度的藻藍(lán)蛋白帶有很強(qiáng)的熒光，制成的純天然熒光試劑，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷，免疫化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程等研究領(lǐng)域。在我國，每年的螺旋藻全國總產(chǎn)量已達(dá)到7000噸。螺旋藻產(chǎn)量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注膠囊的形式當(dāng)作保健品使用。螺旋藻的規(guī)?；_發(fā)和利用處于初級(jí)加工階段，還沒有深加工產(chǎn)品。螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的提取還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，沒有適合于工業(yè)化生產(chǎn)的好的工藝方法。目前，市場(chǎng)上銷售的高純度的藻藍(lán)蛋白商品都是從國外進(jìn)口，價(jià)格昂貴，在應(yīng)用上受到限制。因此，開發(fā)簡(jiǎn)便、快速的螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取過程，提高螺旋藻藻藍(lán)蛋白產(chǎn)品純度是目前螺旋藻藻藍(lán)蛋白的規(guī)模化開發(fā)利用中亟待解決的關(guān)鍵問題。已報(bào)道的有關(guān)制備藻類藻藍(lán)蛋白的專利技術(shù)，例如中國專利CN1106414A、CN1130028A、CN101003565A、CN00117512.2、CN100434528C等的共同特征為藻藍(lán)蛋白提取都需經(jīng)過藻體細(xì)胞破壁、離心或過濾去除細(xì)胞碎片和其它固體微粒、鹽析或等電點(diǎn)粗提階段，然后用離子交換樹脂等層析方法提純，載體的分離藻藍(lán)蛋白的特異性差，過程繁瑣，產(chǎn)品純度低，生產(chǎn)成本高。本發(fā)明提供一種對(duì)藻藍(lán)蛋白具有特異性吸附的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球，可從螺旋藻破壁液中吸附、分離、純化藻藍(lán)蛋白。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前尚未見有關(guān)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球用于富集分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，用于分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白，獲得較高純度的藻藍(lán)蛋白，應(yīng)用于天然色素、保健食品和新藥的研究開發(fā)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中吸附分離藻藍(lán)蛋白。其方法簡(jiǎn)單，快捷，成本低，分離藻藍(lán)蛋白具有較高的回收率、純度，原料既可采用新鮮螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，從而提供了一種解決螺旋藻藻藍(lán)蛋白資源規(guī)模化利用的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案：一種用于分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備方法，步驟為：(1)聚合乳液的制備；(2)進(jìn)行聚合反應(yīng)獲得聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球；(3)用聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球從螺旋藻破壁清液中吸附藻藍(lán)蛋白；(4)藻藍(lán)蛋白從吸附微球上脫附；(5)脫附液經(jīng)濃縮和冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白粉。所述的方案，步驟1中，氧化鎂納米顆粒的直徑為5～50nm，非離子表面活性劑為失水山梨糖醇脂肪酸酯Span-80、平平加AEO9、壬基酚聚氧乙烯醚OP-10中任意一種，氧化鎂納米顆粒與非離子表面活性劑之間的重量比為1:0～2.5，植物油包括大豆油、棉籽油、茶籽油、菜籽油、橄欖油、葵花籽油中的一種，納米顆粒與植物油的重量比為1:10～20，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為20～70％，丙烯酸水溶液與植物油的體積比例為1:1～2，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化,獲w/o型乳狀液。所述的方案，步驟2中，在上述乳狀液中，加入0.2～0.5％的過硫酸鈉(以丙烯酸水溶液的體積計(jì))，于30℃～40℃下在100～200r/min攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時(shí)，過濾得到50～500nm粒徑分布的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球。所述的方案，步驟3中，對(duì)于螺旋藻的細(xì)胞破壁，采用水或磷酸緩沖液作提取劑，磷酸緩沖液的濃度為25～100mmol/L，藻粉或鮮藻與提取液的固液比為1:50～1:150，攪拌均勻后，置于-10℃～-20℃下冷凍一定時(shí)間后，37℃溶解，如此反復(fù)凍融4-6次，融化后離心獲得的破壁清液，破壁清液中蛋白質(zhì)濃度為1.0～5.6mg/ml，藻藍(lán)蛋白純度為0.5～0.72。所述的方案，步驟3中，在500ml三角燒瓶中，加入聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和螺旋藻破壁清液，微球與破壁液的重量比為1:10～25，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附40～90分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球。所述的方案，步驟4中，將飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為500～1000mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，通過離心收集上清液為產(chǎn)品。所述的方案，步驟5中，將收集的含藻藍(lán)蛋白洗脫液真空濃縮和冷凍干燥，即得到純度A620/A280>2.0的藻藍(lán)蛋白粉末。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.按流程：使用聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球從螺旋藻破壁清液中提取藻藍(lán)蛋白的操作方式是分批操作方式，適合不同規(guī)模和場(chǎng)地的工業(yè)化生產(chǎn)要求；2.聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球?qū)υ逅{(lán)蛋白的吸附選擇性高，生產(chǎn)成本低，可再生，適用于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用；3.制備藻藍(lán)蛋白的原料可以是螺旋藻鮮藻或者干藻粉，有效地解決螺旋藻資料的利用和高值化問題。具體實(shí)施方式實(shí)施實(shí)例1(1)螺旋藻破壁清液的制備取產(chǎn)于江蘇東臺(tái)市賜百年生物工程有限公司的鈍頂螺旋藻干粉，用去離子水作提取劑，藻粉與去離子水的固液比為1:50，置于-20℃下冷凍4小時(shí)后，37℃融解，如此反復(fù)凍融4次，融化后的藍(lán)藻破壁液用離心機(jī)在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/ml，藻藍(lán)蛋白純度A620/A280為1.0mg/ml。(2)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備在1000ml的圓底燒瓶中，放入20g納米氧化鎂顆粒(購自博羅縣可萊納米新材料有限公司，平均粒徑50nm)、200ml丙烯酸(購自上海實(shí)建實(shí)業(yè)有限公司)水溶液和200ml的大豆油(購自淄博坤興糧油有限公司)，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為20％，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化，加入0.4g的過硫酸鈉(購自臨沂市天科工貿(mào)有限公司)，于30℃下在200r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時(shí)，過濾得到50～500nm粒徑分布的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球。(3)微球從螺旋藻破壁液中吸附藻藍(lán)蛋白在500ml三角燒瓶中，加入4g聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和100ml螺旋藻破壁清液，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附40分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球。(4)藻藍(lán)蛋白從微球上脫附將飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為500mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，用離心機(jī)在4000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液。(5)冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白粉將前述步驟(4)中獲得的上清液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍(lán)蛋白純度A620/A280為2.3，蛋白回收率為80％。實(shí)施例2(1)螺旋藻破壁液的制備取產(chǎn)于江蘇大豐賜百年生物科技有限公司的新鮮螺旋藻，用50mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:100，置于-10℃下冷凍4小時(shí)后，37℃融解，如此反復(fù)凍融5次。融化后的藍(lán)藻破壁液用離心機(jī)在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為3.1mg/ml，藻藍(lán)蛋白純度A620/A280為0.45。(2)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備在1000ml的圓底燒瓶中，放入20g納米氧化鎂顆粒(購自博羅縣可萊納米新材料有限公司，平均粒徑50nm)和20g失水山梨糖醇脂肪酸酯Span-80(購自江蘇省海安石油化工廠)、200ml的丙烯酸(購自上海實(shí)建實(shí)業(yè)有限公司)水溶液和400ml的菜籽油(購自湖南亞美生物科技有限公司)，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為50％，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化，加入1.0g的過硫酸鈉(購自臨沂市天科工貿(mào)有限公司)，于30℃下在100r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時(shí)，過濾得到50～500nm粒徑分布的聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球。(3)微球從螺旋藻破壁液中吸附藻藍(lán)蛋白在500ml三角燒瓶中，加入4g聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和40ml螺旋藻破壁清液，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附70分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球。(4)藻藍(lán)蛋白從微球上脫附將飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為800mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，用離心機(jī)在4000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液。(5)冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白粉將前述步驟(4)中獲得的上清液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍(lán)蛋白純度A620/A280為3.5，蛋白回收率85％。實(shí)施例3(1)螺旋藻破壁液的制備取產(chǎn)于云南麗江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用100mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:150，置于-20℃下冷凍4小時(shí)后，37℃融解，如此反復(fù)凍融6次。融化后的藍(lán)藻破壁液用離心機(jī)在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中的藻藍(lán)蛋白純度A620/A280為0.72，破壁液蛋白質(zhì)濃度為5.6mg/mlmg/ml。(2)聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球的制備在1000ml的圓底燒瓶中，放入20g納米氧化鎂顆粒(購自博羅縣可萊納米新材料有限公司，平均粒徑50nm)和25g壬基酚聚氧乙烯醚OP-10(購自江蘇省海安石油化工廠)、200ml的丙烯酸(購自上海實(shí)建實(shí)業(yè)有限公司)水溶液和300ml的茶籽油(購自湖南亞美生物科技有限公司)，丙烯酸水溶液中丙烯酸的重量體積濃度為70％，用FlukoFA25型均質(zhì)泵分散乳化，加入0.8g的過硫酸鈉，于40℃下在150r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下攪拌2小時(shí)，過濾得到50～500nm粒徑分布的JDN-8微球。(3)微球從螺旋藻破壁液中吸附藻藍(lán)蛋白在500ml三角燒瓶中，加入4g聚丙烯酸/氧化鎂雜合微球和60ml螺旋藻破壁清液，在室溫條件下，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩吸附90分鐘，過濾收集飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球。(4)藻藍(lán)蛋白從微球上脫附將飽和吸附藻藍(lán)蛋白的微球置于100ml的pH值為7.0、濃度為1000mmol/L的磷酸緩沖液中，于轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上震蕩15分鐘，用離心機(jī)在4000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液。(5)冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白粉將前述步驟(4)中獲得的上清液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍(lán)蛋白純度A620/A280為3.0，蛋白回收率75.5％。