含離子液體共溶劑介質中制備(R)?3,5?雙三氟甲基苯乙醇的方法與流程

含離子液體共溶劑介質中制備(R)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇的方法(一)技術領域本發明涉及一種基因工程菌及其應用，特別涉及一種重組大腸桿菌工程菌及其在含離子液體共溶劑體系中生物還原制備(R)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇的方法。(二)

背景技術：
2003年美國FDA批準上市的第一個神經激肽-1(NK-1)受體阻滯劑藥物，即阿瑞吡坦(Aprepitant，商品名：)。該藥物通過與NK-1受體結合從而阻斷P物質的作用來達到止吐的效果，廣泛應用于治療癌癥病人化療時產生的惡性嘔吐的副作用。2008年在美國、瑞典、捷克、葡萄牙和英國等國上市了另一個止吐藥物，即福沙吡坦(Fosaprepitant，商品名：)，該藥物是阿瑞吡坦的前體藥物，在體內能迅速轉化成阿瑞吡坦從而發揮止吐效果。(R)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇是合成阿瑞吡坦和福沙吡坦等化療止吐藥物的關鍵手性模塊。離子液體是一類具有不易揮發，不易燃和高穩定性等獨特性能，可作為純溶劑，輔助溶劑，或與其他溶劑一起構成兩相體系廣泛應用于生物催化、有機合成、化學分離等反應過程。離子液體可通過匹配特定需求的陽離子或陰離子改變其性質，從而有利于提高生物催化劑的催化效率。近年來，有關含離子液體介質中的生物催化過程研究使得生物催化劑的催化活性、立體選擇性和穩定性相應的得到提高。離子液體介質中重組工程菌生物還原3,5-雙三氟甲基苯乙酮(BTAP)制備(R)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)的反應過程如圖1所示。本申請人的在先申請中國專利2013101896727(公開號CN103421823A)提供了一種以重組工程菌或其表達的短鏈脫氫酶為生物催化劑，對一些潛手性酮不對稱還原獲得相應手性醇的方法。該方法在水相體系中進行，且只有在較低的底物濃度下(50mM)，產率才能達到90％以上，當底物濃度大于200mM時，由于底物3,5-雙三氟甲基苯乙酮在水相中的低溶解性引起的傳質問題，以及底物對細胞的潛在毒性限制了反應的底物濃度的進一步提高，造成產率偏低。本申請采用含離子液體介質體系進行重組工程菌催化不對稱還原反應，由于離子液體對底物具有增溶作用，可有效解決非天然底物水難溶性問題；且離子液體的加入可改變作為催化劑的全細胞的細胞膜通透性，減少底物和產物的抑制作用；從而提高了還原反應的效率。(三)

技術實現要素：
本發明目的是提供一種在含離子液體共溶劑的反應體系中有效提高重組基因工程菌在高底物濃度(200～1500mM)條件下不對稱還原3,5-雙三氟甲基苯乙酮制備(R)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇的產率的新方法。本發明采用的技術方案是：本發明提供一種在含離子液體共溶劑體系中制備(R)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇的方法，所述方法為：以3,5-雙三氟甲基苯乙酮為底物，以重組基因工程菌經發酵培養獲得的濕菌體為催化劑，以式(Ⅰ)所示離子液體和pH6.0～8.0(優選pH7.0)磷酸鹽緩沖液為反應介質構成反應體系，于20～45℃、200rpm條件下進行生物催化不對稱還原反應，反應完全后，反應液經分離純化得到(R)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇；所述重組基因工程菌是由來源于雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904短鏈脫氫酶突變體基因構建的重組表達載體轉化宿主菌獲得的，所述短鏈脫氫酶突變體基因的核苷酸序列為SEQIDNO.3所示；所述底物的初始濃度為200mM～1500mM(優選1200mM)，所述濕菌體的用量以反應體系總體積計為20～200g/L(優選50g/L)，所述離子液體的質量用量以反應體系總體積計為10～50g/L(優選35g/L)，所述異丙醇的體積終濃度為10～50％(優選20％)；[NR1,R2,R3,R4]L(Ⅰ)式(Ⅰ)中陽離子為取代季銨鹽，陰離子為天然氨基酸、四氟硼酸鹽、六氟磷酸鹽、雙(三氟甲烷磺酰)亞胺鹽，其中取代季銨鹽的取代基R1、R2、R3和R4各自獨立為C1～C4的烷基。本發明所述離子液體的制備方法參照在先申請(申請號201310754767，公開號CN103695480A)，優選所述離子液體為下列之一：四甲基銨半胱氨酸([N1,1,1,1][Cys])、四乙基銨半胱氨酸([N2,2,2,2][Cys])、四甲基銨谷氨酸([N1,1,1,1][Glu])、四乙基銨谷氨酸([N2,2,2,2][Glu])、四甲基銨六氟磷酸([N1,1,1,1][PF6])、四乙基銨六氟磷酸([N2,2,2,2][PF6])、四丙基銨六氟磷酸([N3,3,3,3][PF6])、四丁基銨六氟磷酸([N4,4,4,4][PF6])、四甲基銨四氟硼酸([N1,1,1,1][BF4])、四乙基銨四氟硼酸([N2,2,2,2][BF4])、四丙基銨四氟硼酸([N3,3,3,3][BF4])、四丁基銨四氟硼酸([N4,4,4,4][BF4])、四甲基銨雙(三氟甲烷磺酰)亞胺鹽([N1,1,1,1][Tf2N])、四乙基銨雙(三氟甲烷磺酰)亞胺鹽([N2,2,2,2][Tf2N])、四丙基銨雙(三氟甲烷磺酰)亞胺鹽([N3,3,3,3][Tf2N])、四丁基銨雙(三氟甲烷磺酰)亞胺鹽([N4,4,4,4][Tf2N])。進一步，所述底物的優選濃度為1200mM。進一步，所述離子液體為四甲基銨半胱氨酸，四乙基銨半胱氨酸，四甲基銨谷氨酸或四乙基銨谷氨酸。進一步，所述分離純化的方法為：反應結束后，將反應液用等體積的乙酸乙酯萃取，離心收集乙酸乙酯層，將乙酸乙酯層減壓濃縮至無液體流出，獲得濃縮液，將濃縮液進行硅膠柱層析，以體積比8:1的石油醚和乙酸乙酯混合液為洗脫劑進行洗脫，TLC跟蹤，收集Rf值為0.3～0.6的洗脫液，減壓濃縮至干，即得產物。本發明中所述的產物產率和產物ee值測定采用氣相色譜法。氣相色譜的檢測條件為：日本島津GC-2014氣相色譜儀，N2000色譜工作站，美國Chirasil-DexCB毛細管柱。載氣為氮氣；流速為2mL/min；進樣量：1μL；分流比為15:1；檢測器為氫火焰離子檢測器；進樣口溫度和檢測器溫度為250℃；柱溫為程序升溫：80℃保留2min，然后以8℃/min升溫至150℃，保留5min。產率計算方法為：內標法：以十二烷為內標物，測得產物濃度標準曲線。測定時在樣品中加入一定量的十二烷為內標物，根據內標物濃度計算得出產物濃度。產物的產率由下述公式計算獲得：式中C0、C產物分別為反應起始時底物的摩爾濃度和反應結束時產物的摩爾濃度。產物的光學純度由對映體過量值(enantiomericexcess,ee)來表征。計算公式為：式中CR和CS分別為R型和S型3,5-雙三氟甲基苯乙醇的摩爾濃度。本發明所述重組基因工程菌是將來源于雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904的短鏈脫氫酶基因(記為LXCAR，核苷酸序列為SEQIDNO.1所示，編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO.2所示)進行突變，通過將SEQIDNO.2所示氨基酸序列154位的絲氨酸突變為酪氨酸，獲得短鏈脫氫酶突變體(核苷酸序列為SEQIDNO.3所示，編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO.4所示)，繼而以短鏈脫氫酶突變體基因構建的重組表達載體轉化宿主菌而獲得的，優選重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR。雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904短鏈脫氫酶基因工程菌的構建及表達已在先前...