：本發明屬于藥物技術領域，涉及一組新化合物及其制備方法，以及該化合物在制備降血糖藥物中的應用。
背景技術：
：糖尿病是由于胰腺的功能失調導致胰島素分泌相對或絕對不足，或靶細胞對胰島素的敏感性降低而引起的一系列全身性代謝紊亂疾病。據世界衛生組織資料，全世界有3.46億人患有糖尿病，嚴重威脅人類健康。目前的治療藥物主要有胰島素類、胰島素分泌促進劑、胰島素增敏劑和碳水新化合物。胰島素類藥物對于胰島素依賴型糖尿病患者，不用胰島素病情就惡化，一旦用上就難以撤除；胰島素分泌促進劑如磺脲類，血糖濃度依賴，易低血糖，易導致腹型肥胖；增加胰島β細胞負荷，導致胰島功能衰竭；長效用藥導致嚴重的低血糖難以糾正等；胰島素增敏劑，其中雙胍類易引起胃腸道和消化道不良反應，而噻唑烷二酮類價格高，應用前提是胰島功能尚可而胰島素受體結合率低；碳水新化合物，消化道副作用強，肝功能不全者也應慎用。鑒于上述種種原因，人們把目光轉向天然降血糖藥物的研發上。天然藥物降血糖在毒副作用方面比化學藥物具有獨到之處，因此，從祖國醫藥寶庫中尋找療效確切的降血糖天然藥物，明確其藥效物質基礎，進而開發出高效低毒的新藥，成為中醫藥領域多年研究的焦點。苦瓜MomordicacharantiaL.始載于《滇南本草》和《本草綱目》列于菜部菜類,曰：“苦寒無毒,除邪熱,解勞乏，清心名目。”苦瓜廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區,在許多國家和地區都有入藥記載。苦瓜藥食同源的特性和顯著的生理活性使其成為近年來人們研究的熱點。在傳統中醫領域中的《救荒本草》和《本草綱目》等古文獻里，都曾經提到苦瓜能止渴，主治煩熱渴引飲，在治療消渴癥即糖尿病方面有獨特功效。本發明在針對苦瓜降血糖有效成分的研究中，經過醇提取、色譜分離純化與細胞活性檢測相結合的方法，最終獲得了具有降血糖活性的一組新化合物，并采用質譜與高分辨核核磁共振和單晶衍射等技術，確定了各個新化合物的化學結構。上述新化合物均具有良好的降血糖活性，可以開發制成適合于臨床使用的降血糖藥物。如作為先導新化合物，通過結構改造和對其構效關系進行進一步的研究，可合成一系列的降血糖藥物和新的藥物組合。也可作為苦瓜藥材及其制劑質量評價的指標成分，實現苦瓜藥材及其制劑質量的穩定和可控，為一類降血糖創新藥物的研究突破目前苦瓜研究開發的瓶頸奠定基礎。
技術實現要素：
本發明目的是提供一組從中藥苦瓜中提取分離得到的新化合物。本發明另一目的是提供上述新化合物的制備方法。本發明另一目的是提供上述新化合物在制備降血糖藥物中的用途。本發明另一目的是提供上述新化合物作為先導藥物的用途，用于合成降血糖藥物。本發明另一目的是提供上述新化合物作為中藥對照品的用途，用于檢測和鑒別苦瓜藥材。本發明另一目的是提供含有上述新化合物的藥物組合物，可用于治療糖尿病。本發明另一目的是提供中藥苦瓜的檢測方法，該方法中以上述新化合物作對照品。上述目的通過以下技術方案實現：化合物，其具有下式結構Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ之一：上述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和/或Ⅳ的制備方法是：a)取干燥的苦瓜用醇、水或醇-水任意比例混合提取，提取液濃縮，濃縮后將濃縮液經酸水解，水解后的反應液加水離心或靜置，收集沉淀部分，或者水解后的反應液經堿中和后用有機溶劑萃取，收集有機溶劑部分；b)干燥沉淀部分或有機溶劑部分，即得苦瓜水解產物，將苦瓜水解產物上200-300目硅膠分離，用溶劑洗脫，硅膠薄層定性，合并相同組分，即得粗品；c)粗品用溶劑重結晶，即得含有化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的混合物；該混合物經高效液相色譜方法制備，用甲醇-水作流動相洗脫，分別得到化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的單體。作為優選的實施方式，上述制備方法中所述的步驟b）的溶劑為石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮的任意兩者或三者的組合；步驟c）的溶劑為92%甲醇-水；步驟a）所述的醇為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇之一或兩種以上的混合物；所述醇-水的比例是1%-95%體積比，優選70%體積比。作為優選的實施方式，上述制備方法中的苦瓜是指來自葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜的未成熟果實。作為優選的實施方式，上述制備方法中所述步驟a)中的提取是加熱回流提取或滲濾提取或超聲提取或微波提取或閃式提取；所述用醇提取包括將干燥后的苦瓜用醇提取2次，每次提取2小時，合并提取液，提取液減壓濃縮至25℃時密度為1.00-1.50。作為優選的實施方式，上述制備方法中步驟a)的濃縮液經酸水解具體是在酸性水溶液或有機溶劑中在超聲條件下進行，其中濃縮液的用量10-800g/L，g指醇提取物的質量單位；酸為鹽酸、硫酸、高氯酸、磷酸、冰乙酸或甲酸，濃度為0.2-9mol/L或為上述酸的飽和酸；或者為有機酸，例如蘋果酸、檸檬酸、草酸、酒石酸、抗壞血酸、苯甲酸、水楊酸或咖啡酸等。超聲條件：頻率：20-70kHz；功率：2.4-6KW；時間：1-120分鐘；水溫：25-100℃；中和萃取為第一種方法，水解后的反應液用氫氧化鈉或氫氧化鉀中和，其濃度優選0.2-9mol/L；萃取用的有機溶劑為石油醚、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯或正丁醇；柱層析用硅膠粒度為200-300目；水解溫度為：25-100℃，時間1分鐘-5天。作為優選的實施方式，上述制備方法中：取干燥的苦瓜用醇提取，提取液濃縮，濃縮后將濃縮液經鹽酸水解，加水離心，收集沉淀部分，干燥沉淀部分即得苦瓜水解產物，離心沉淀為第二種方法。將苦瓜水解產物上200-300目硅膠分離，用石油醚-乙酸乙酯50:1，30:1，15:1的混合液依次洗脫，每個梯度洗脫5個柱體積，硅膠薄層定性，合并相同組分，30:1組分得到粗品，粗品用乙酸乙酯重結晶后即得含有化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的混合物，該混合物經高效液相色譜方法制備，用甲醇-水作流動相洗脫，分別得到化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的單體。上述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在制備降血糖藥物中的應用。本發明具有以下有益效果：1、本發明提供了一組具有降血糖作用的新化合物，通過對PTP1B抑制試驗和藥效學試驗，證明了該組化合物具有優良的降血糖活性，可制成適合于臨床使用的降血糖藥物。2、采用本實驗的篩選方法從中藥苦瓜中分離純化了化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，且純度達到98%以上。上述化合物為從天然植物中提取分離，具有結構新穎、作用獨特的優點，一方面可與藥物賦形劑制成適合于臨床使用的降血糖藥物，另一方面也可作為先導新化合物，對其構效關系進行進一步研究，合成一系列的降血糖藥物和藥物組合。3、中藥及其制劑質量的穩定和可控一直是中藥現代化的瓶頸，上述化合物為中藥苦瓜的有效成分之一，可以作為苦瓜藥材及其制劑質量控制的指標，在其基礎上建立以該成分為指標的鑒別和含量測定項目的質量控制標準，實現苦瓜藥材及其制劑質量的穩定和可控，上述化合物將作為中藥對照品廣泛使用。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但發明的實施方式不限于此。實施例1：取干燥的苦瓜未成熟果實用70%乙醇加熱回流提取，提取2次，每次提取2小時，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑得到乙醇苦瓜提取物。經酸水解（方法見實施例3-9），制得苦瓜水解產物。將苦瓜水解產物上200-300目硅膠分離，用石油醚-乙酸乙酯50:1，30:1，15:1梯度洗脫，每個梯度洗脫5個柱體積，硅膠薄層定性，合并相同組分，30:1洗脫收集部分得到化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的混合物。該混合物經高效液相色譜方法制備，液相條件為：溫度：室溫；紫外檢測波長：203nm；流動相：92%甲醇-水；流速：3.5mL/min；最大進樣量/次：＜1mg，4個色譜峰之間有良好的分離度，故確定此條件為制備分離的最佳液相條件，峰1(化合物I)的保留時間為27.8分鐘，峰2(化合物II)的保留時間為31.6分鐘、峰3(化合物III)的保留時間為35.2分鐘、峰4(化合物IV)的保留時間為40.2分鐘。經過拆分，得到化合物I為20mg、化合物II為12mg、化合物III為40mg、化合物IV為20mg，純度均為98%。新化合物的結構測定用ShimadzuUV-2201分光光度計測定紫外光譜，用BrukerIFS-55（KBr壓片）分光光度計測定紅外光譜，用Perkin-Elmerpolarimeter測定旋光度，用LCQmassanalyzer測定ESI-MS，用BICmicroTOF-Qmassspectrometer測定HR-TOF-MS，1H-和13C-NMR譜用BrukerAV-600和ARX-300，TMS做內標。化合物Ⅰ白色粉末(甲醇)。UV(cyclohexane)λmax(logε)211.0(3.20)nm；IR(KBr)νmax3501、2917、2849、1702、1646、1471、1383、1115、1083cm-1；HR-ESI-MS的準分子離子峰：m/z523.3731[M+Na]+(C32H52O4Na，計算值為523.3758)，結合NMR推測化合物的分子式為C32H52O4。1HNMR(300MHz,CDCl3)：δ0.851(3H,s)、0.853(3H,s)、0.88(3H,s)、1.25(3H,s)、1.70(3H,s)、1.78(3H,s)、0.91(3H,d,J=6.3Hz)為七個甲基質子信號，δ3.23(3H,s)、3.43（3H,s）為兩個甲氧基質子信號，同時存在δ5.98(1H,dd,J=3.3,9.6Hz)、5.64(1H,dd,J=3.0,9.6Hz)和4.95(1H,d,J=8.7Hz)烯氫質子信號。13CNMR(75MHz,CDCl3)給出了32個碳信號。δ55.2、58.1為兩個甲氧基碳信號，δ136.3、132.7、130.9和126.2為烯碳信號，δ86.7一個連氧次甲基碳信號，δ112.4一個縮醛次甲基碳信號。綜上所述故鑒定化合物Ⅰ為5α,19S-epoxy-19,23-dimethoxycucurbita-6,24–dien-3β-ol為一未見報道的新化合物，碳氫譜數據歸屬和化學結構見表1。化合物Ⅱ白色粉末(甲醇)。UV(cyclohexane)λmax(logε)211.2(3.20)nm；IR(KBr)νmax3526、2953、2876、1732、1647、1466、1383、1111、1080cm-1；HR-ESI-MS的準分子離子峰：m/z523.3746[M+Na]+(C32H52O4Na，計算值為523.3758)，結合NMR推測化合物的分子式為C32H52O4。1HNMR(300MHz,CDCl3)：δ0.85(3H,s)、1.78(3H,s)、1.71(3H,s)、0.88(3H,s)、1.25(3H,s)、0.85(3H,s)、0.91(3H,d,J=6.3Hz)為七個甲基質子信號，δ3.23(3H,s)、3.43（3H,s）為兩個甲氧基質子信號，同時存在δ5.50(1H,dd,J=3.6,9.6Hz)、6.08(1H,dd,J=1.8,9.6Hz)和4.91(1H,brd,J=9.6Hz)烯氫質子信號。13CNMR(300MHz,CDCl3)給出了32個碳信號。δ55.2、57.2為兩個甲氧基碳信號，δ136.3、133.0、130.4和126.1為烯碳信號，δ85.0一個連氧次甲基碳信號，δ114.7一個縮醛次甲基碳信號。化合物Ⅱ的晶體屬于斜方晶系，晶胞參數為α=90°，β=105.950(8)°，γ=90°,Z=1,Dc=0.968mg/cm3,最終獲得一致性因子R1=0.0413,wR2=0.0934(w=1/σ|F|2),S=1.064.X射線單晶衍射結構分析顯示，化合物2含有三個六元環和兩個五元環結構。相對構型由NOESY譜圖闡明，絕對構型見前文結構式Ⅱ。綜上所述故鑒定化合物Ⅱ為5α,19R-epoxy-19,23-dimethoxycucurbita-6,24-dien-3β-ol為一未見報道的新化合物，碳氫譜數據歸屬和化學結構見表1。化合物Ⅲ白色粉末(甲醇)。UV(cyclohexane)λmax(logε)210.4(3.20)nm；IR(KBr)νmax3471、2926、2882、1732、1647、1469、1383、1115、1084cm-1；HR-ESI-MS的準分子離子峰：m/z523.3752[M+Na]+(C32H52O4Na，計算值為523.3758)，結合NMR推測化合物的分子式為C32H52O4。1HNMR(300MHz,CDCl3)：δ0.88(3H,s)、1.74(3H,s)、1.68(3H,s)、0.85(3H,s)、1.22(3H,s)、0.85(3H,s)、0.925(3H,d,J=6.6Hz)為七個甲基質子信號，δ3.12(3H,s)、3.43（3H,s）為兩個甲氧基質子信號，同時存在δ5.964(1H,dd,J=3.3,9.3Hz)、5.63(1H,dd,J=3.0,9.3Hz)和5.023(1H,brd,J=8.4Hz)烯氫質子信號。13CNMR(75MHz,CDCl3)給出了32個碳信號。δ55.7、57.2為兩個甲氧基碳信號，δ134.4、132.8、130.9和127.0為烯碳信號，δ86.7一個連氧次甲基碳信號，δ112.0一個縮醛次甲基碳信號。化合物3的晶體屬于斜方晶系、晶胞系數為a=β=g=90°,Z=1,Dc=1.001mg/cm3,最終獲得一致性因子R1=0.0729,wR2=0.1449(w=1/s|F|2),S=1.019。X射線單晶衍射結構分析顯示，化合物3含有三個六元環和兩個五元環結構。23位甲氧基是在平面下。相對構型由NOESY譜圖證明，絕對構型見前文結構式Ⅲ。綜上所述故鑒定化合物Ⅲ為5β,19R-epoxy-19,23-dimethoxycucurbita-6,24-dien-3β-ol，為一未見報道的新化合物。碳氫譜數據歸屬和化學結構見表1。化合物Ⅳ白色粉末(甲醇)。UV(cyclohexane)λmax(logε)210.8(3.20)nm；IR(KBr)νmax3525、2939、2875、1732、1647、1466、1382、1113、1083cm-1；HR-ESI-MS的準分子離子峰：m/z523.3750[M+Na]+(C32H52O4Na，計算值為523.3758)，結合NMR推測化合物的分子式為C32H52O4。1HNMR(300MHz,CDCl3)：δ0.88(3H,s)、1.74(3H,s)、1.68(3H,s)、0.88(3H,s)、1.25(3H,s)、0.85(3H,s)、0.94(3H,d,J=6.3Hz)為七個甲基質子信號，δ3.21(3H,s)、3.40（3H,s）為兩個甲氧基質子信號，同時存在δ5.51(1H,dd,J=3.6,9.9Hz)、6.08(1H,dd,J=1.5,9.6Hz)和5.02(1H,brd,J=8.7Hz)烯氫質子信號。13CNMR(75MHz,CDCl3)給出了32個碳信號。δ55.7、57.3為兩個甲氧基碳信號，δ134.5、133.0、130.5和127.0為烯碳信號，δ85.1一個連氧次甲基碳信號，δ114.7一個縮醛次甲基碳信號。綜上所述故鑒定化合物Ⅳ為5β,19S-epoxy-19,23-dimethoxycucurbita-6,24-dien-3β-ol為一未見報道的新化合物，碳氫譜數據歸屬和化學結構見表1。表1化合物Ⅰ-Ⅳ的13CNMR(75MHz，CDCl3)和1HNMR(300MHz,CDCl3)光譜數據實施例2上述化合物抑制PTP1B的活性實驗抑制PTP1B酶的活性實驗在96孔板中進行，實驗組依次加入83μL含酶緩沖溶液、10μL待測樣品溶液和4μL底物溶液，陽性對照組依次加入83μL含酶緩沖溶液、10μL釩酸鈉溶液和4μL底物溶液。試劑對照組加入83μL含酶溶液、10μLDMSO溶液和4μL底物溶液，在恒溫培養箱中37℃反應30分鐘后，用5μLNaoH終止反應。通過酶標儀測量產物在410nm處的紫外吸收強度。溶液配制①儲存液分別取0.6055gTris和0.0584gEDTA加蒸餾水稀釋至20mL，用濃鹽酸調節pH至7.5。終濃度Tris-HCl為250mM，EDTA為10mM。保存條件：4℃可長期保存。②緩沖液取1mL儲存液，加蒸餾水稀釋至10mL，并加入0.0015gDTT和0.718μLβ-mercaptoethanol。此時緩沖液含25mMTris-HCl、1mMEDTA、1mMDTT、2mMβ-mercaptoethanol。此溶液需現用現配。③底物溶液稱取0.1856g于pNPP1.5mLEP管，用1mL緩沖溶液稀釋，。保存條件：用錫紙包裹，保存于-20℃的冰柜中。④釩酸鈉溶液取0.816g十二水釩酸鈉，加100mL蒸餾水,將溶液加熱沸騰至半透明，并調節pH至10左右，用移液槍取1mL溶液至100mL燒杯中，用玻璃棒攪拌混勻，再次加熱至沸騰至半透明，確保釩酸鈉為單體形式，待冷卻后分裝于1.5mLEP管中，-20℃冷凍保存。⑤PTP1B酶溶液原始包裝為50μg/50μL,含25mMTris-HCl（pH7.5），2mMβ-mercaptoethanol,1mMEDTA,1mMDTT和20%Glycerol。保存條件：4℃凍存2-4周，-20℃凍存時間更長，若長時間凍存可添加0.1%牛血清白蛋白或人血清白蛋白。避免反復凍融。使用時取35.4μL酶溶液加緩沖液稀釋至8.3mL，可供96孔使用。可根據每次實驗新化合物數量、濃度梯度、平行數量按比例配置PTP1B酶溶液。⑥待測樣品溶液用EP管準確稱量新化合物，溶解在DMSO中，使濃度為10mmol/L，成為原液。用移液槍取30μL原液，加970μLDMSO，用振蕩器混合均勻，成為待測樣品溶液1。從待測樣品溶液1中取30μL加70μLDMSO，成為待測樣品溶液2，即為高濃度和低濃度待測樣品溶液。⑦終止溶液2MNaOH。評價指標測定在不同濃度下對基因重組PTP1B的相對抑制率的計算公式如下：其中對照組為試劑對照組。表2化合物對PTP1B的相對抑制率以上實驗數據表明，化合物I、II、III和IV對PTP1B具有顯著的抑制作用，它們的濃度為30μM的抑制率分別為77%，62%，40%和62%。實施例3苦瓜提取物的鹽酸水解法3.1稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加濃鹽酸10mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：50kHz；功率：3KW；時間：30分鐘；在溫度40℃水解12h。水解后的反應液加水1000mL，靜置后沉淀部分用水洗反復至中性后靜置，收集沉淀，濾過，干燥后即得苦瓜水解產物。3.2稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加濃鹽酸10mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：50kHz；功率：3KW；時間：30分鐘；在溫度40℃水解12h，水解液用2.5mol/L氫氧化鈉中和后用氯仿萃取，水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，回收氯仿液后收集殘余物，干燥后即得苦瓜水解產物。實施例4苦瓜提取物的硫酸水解法稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加44%硫酸15mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：50kHz；功率：3KW；時間：20分鐘；在溫度40℃水解8小時。水解后的反應液加水1000mL，靜置后沉淀部分用水洗反復至中性后靜置24小時，收集沉淀，濾過，干燥后即得苦瓜水解產物。實施例5苦瓜提取物的高氯酸水解法稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加43%高氯酸16mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：40kHz；功率：2KW；時間：30分鐘；在溫度40℃水解12h，水解液用3.0mol/L氫氧化鈉中和后用氯仿萃取，水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，回收氯仿液后收集殘余物，干燥后即得苦瓜水解產物。實施例6苦瓜提取物的磷酸水解法稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加45%磷酸15mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：50kHz；功率：3KW；時間：60分鐘；，在溫度40℃水解24h，水解液用2.5mol/L氫氧化鈉中和后用氯仿萃取，水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，回收氯仿液后收集殘余物，干燥后即得苦瓜水解產物。實施例7苦瓜提取物的冰醋酸水解法稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加冰醋酸8.3mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：60kHz；功率：3KW；時間：50分鐘；在溫度50℃水解12h，水解液用2.5mol/L碳酸鈉中和后用氯仿萃取，水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，回收氯仿液后收集殘余物，干燥后即得苦瓜水解產物。實施例8苦瓜提取物的甲酸水解法稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加甲酸5.0mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：60kHz；功率：3KW；時間：50分鐘；在溫度50℃水解12h，水解后的反應液加水1000mL，靜置后沉淀部分用水洗反復至中性后靜置24小時，收集沉淀，濾過，干燥后即得苦瓜水解產物。實施例9苦瓜提取物的檸檬酸水解法稱取苦瓜提取物10g，超聲溶于50mL甲醇，緩緩滴加檸檬酸3.0mL（同時攪拌）后進行超聲水解。超聲條件：頻率：60kHz；功率：3KW；時間：60分鐘；在溫度50℃水解12h，水解液用2.0mol/L碳酸鈉中和后用氯仿萃取，水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，回收氯仿液后收集殘余物，干燥后即得苦瓜水解產物。