抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體的制作方法與工藝

本發明涉及一種抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體、其編碼核苷酸序列、高效表達該人源化單克隆抗體的重組真核表達載體、制備所述人源化單克隆抗體的方法、所述人源化單克隆抗體及其組合物的用途。

背景技術：
發現于1995年的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand，簡稱TRAIL或Apo2L或TNFSF10)，定位于3號染色體的3q26，屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，是由281個氨基酸組成的II型跨膜糖蛋白。其C末端在胞外，具有TNF家族的同源性序列。TRAIL受體2(簡稱TRAIL-R2或死亡受體5或DR5)廣泛表達于多種腫瘤細胞表面，而不表達或較少表達于正常細胞表面，其胞外區包含其天然配體TRAIL結合區，胞內區包含死亡結構域(deathdomain)。DR5與TRAIL或其它激動劑結合后可發生同源三聚化，其死亡結構域募集胞內相關蛋白形成死亡誘導信號復合體(death-inducingsignalcomplex，DISC)，激發下游細胞死亡信號轉導，從而特異性地誘導腫瘤細胞死亡。前期研究證明，鼠抗人DR5的激動性單克隆抗體AD5-10能夠誘導體外培養的多種腫瘤細胞死亡，在體內高效抑制裸鼠體內人移植瘤的形成和生長，對正常組織和細胞沒有毒性(GuoYetal.，Anovelanti-humanDR5monoclonalantibodywithtumoricidalactivityinducescaspase-dependentandcaspase-independentcelldeath.JBiolChem2005；280(51)：41940-52；WO2006/017961，ZL200410070093.1)，顯示了良好的臨床應用前景。但是，鼠源單克隆抗體作為異種免疫球蛋白，應用于人體可被人免疫系統識別而產生人抗鼠抗體(humananti-mouseantibody，HAMA)反應，削弱其治療效果，并可能對人體器官產生損傷。因此，將鼠源單克隆抗體進行人源化改造，在保持其親和力和特異性的基礎上降低其對人體的免疫原性，是將所述鼠源抗體成功應用于人類疾病治療的重要途徑。第一代抗體的人源化改造是將鼠源抗體的可變區和人源抗體的恒定區相連接，組成人-鼠嵌合抗體。由于嵌合抗體的可變區和恒定區在空間結構上相對獨立，雖可較好地保持原鼠源抗體的親和力，但完整的鼠源抗體可變區仍可能引起HAMA反應。在嵌合抗體的基礎上，進一步采用互補決定區(complementarity-determiningregion，CDR)移植技術，將鼠源單抗可變區中相對保守的骨架區(frameregion，FR)替換成人的FR區，只保留與抗原結合的CDR區，構建功能性的人源化單克隆抗體，可以最大限度地減少鼠源抗體分子的免疫原性。同時，由于FR區不僅起到抗體分子的支持骨架作用，還涉及抗原抗體結合時正確構象的形成。因此，對人源化抗體分子FR區中關鍵的氨基酸殘基還要進行回復突變，以最大限度地保持鼠源抗體的親和力和特異性。此外，由于在人源化抗體分子中，只有重鏈和輕鏈可變區中互補決定區(CDR)和框架區(FR)的數個氨基酸殘基來源于所免疫動物的種屬，其余部分則全來自于人類的同型抗體，可以在保持鼠源單抗特異性和親和力的基礎上，最大限度地減少人抗鼠抗體反應，延長其在體內的半衰期，改善其藥代動力學特性。而且，人源化抗體具有抗體依賴的細胞毒反應(antibody-dependentcellularcytotoxicity，ADCC)和補體依賴的細胞毒反應(complement-dependentcellularcytotoxicity，CDCC)等人類抗體的效應功能，更有利于臨床應用。哺乳動物細胞表達系統具備完整的轉錄、翻譯和翻譯后加工與分泌機制，可以高效產生具有正確的折疊、裝配、空間構象和良好生物學效應的完整抗體分子，是人源化抗體最理想的表達體系。因此，真核表達載體的構建對于提高人源化抗體的表達水平非常重要。理想的真核表達載體需要強的啟動子和適當的篩選標志，既有利于基因本身的擴增，又有利于陽性細胞的篩選。因此，本發明的技術目的在于制備抗人DR5人源化單克隆抗體及其真核表達載體和所述人源化單克隆抗體在治療多種腫瘤中的應用。

技術實現要素：
本發明的技術目的在于提供一種抗人DR5的人源化單克隆抗體。因此，本發明的第一方面涉及一種抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體，其包括與SEQIDNO：1所示的氨基酸序列同一性至少為90％的輕鏈可變區氨基酸序列，與SEQIDNO：2所示的氨基酸序列同一性至少為90％的重鏈可變區氨基酸序列，和人抗體的恒定區。優選地，所述人源化單克隆抗體的重鏈恒定區為人抗體IgG1的恒定區，輕鏈恒定區為人抗體的κ鏈。優選地，所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列分別為：CDRL1：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQIDNO：3)；CDRL2：KVSNRFS(SEQIDNO：4)；CDRL3：FQSTHVPHT(SEQIDNO：5)；和/或所述人源化單克隆抗體的重鏈可變區CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列分別為：CDRH1：DFSMN(SEQIDNO：6)；CDRH2：WINTETGEPTYADDFKG(SEQIDNO：7)；CDRH3：IDY(SEQIDNO：8)。優選地，所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區的骨架區FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列分別為：FRL1：DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸a代表I或V(SEQIDNO：9)；FRL2：WYLQKPGQSPQLLIY(SEQIDNO：10)；FRL3：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbC，其中氨基酸b代表Y或F(SEQIDNO：11)；FRL3：FGQGTKLEIKR(SEQIDNO：12)；和/或所述人源化抗體的重鏈可變區的骨架區FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列分別為：FRH1：cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFT，其中氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P(SEQIDNO：13)；FRH2：WVRQAPGQGLfWMG，其中氨基酸f代表E或K(SEQIDNO：14)；FRH3：RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkR，其中氨基酸g代表V或A，氨基酸h代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V(SEQIDNO：15)；FRH4：WGQGTTVTVSS(SEQIDNO：16)。優選地，所述人源化單克隆抗體包括與SEQIDNO：1所示的氨基酸序列同一性至少為91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的輕鏈可變區氨基酸序列，和與SEQIDNO：2所示的氨基酸序列同一性至少為91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的重鏈可變區氨基酸序列。優選地，所述人源化單克隆抗體的序列如SEQIDNO：17所示。優選地，所述人源化單克隆抗體選自AD10、AD14或AD15，其中AD10的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如SEQIDNO：18和SEQIDNO：19所示，AD14的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如SEQIDNO：20和SEQIDNO：21所示，AD15的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如SEQIDNO：22和SEQIDNO：23所示。本發明的第二方面涉及一種如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體的編碼核苷酸序列，優選地，所述編碼核苷酸序列分別是在編碼重鏈可變區、恒定區以及輕鏈可變區、恒定區組成的人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸序列之間加入具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列，優選地，所述編碼核苷酸序列編碼的人源化單克隆抗體的重鏈、Furin/2A肽和輕鏈的氨基酸序列如SEQIDNO：17所示。本發明的第三方面涉及一種穩定表達上述第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體的重組真核表達載體，其中上述第二方面所述的人源化單克隆抗體的編碼核苷酸序列被有效地連接到真核表達載體中以進行表達，優選地，所述重組真核表達載體帶有CAG強啟動子(acytomegalovirusimmediateearlyenhancerandachickenbeta-actinpromoter)和二氫葉酸還原酶(dhfr)篩選標記，優選地，所述真核表達載體質粒為pcDNA3。本發明的第四方面涉及一種制備如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體的方法，其包括以下步驟：A)用如第三方面所述的重組真核表達載體轉染HEK293細胞；B)用特異性的親和層析法對所表達的人源化單克隆抗體進行純化。本發明的第五方面涉及一種由活性成分為如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體與TRAIL或其它抗腫瘤藥物組成的組合物，優選地，所述抗腫瘤藥物是表柔比星(epirubicin)。本發明的第六方面涉及一種如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體、如第二方面所述的第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體的編碼核苷酸序列、如第三方面所述的穩定表達第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體的重組真核表達載體或根據第五方面所述的由活性成分為如第一方面所述的抗人死亡受體5胞外區的人源化單克隆抗體與其它化療藥物組成的組合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途，優選地，所述腫瘤為白血病、肝癌、結腸癌、肺癌或卵巢癌。換言之，為了完成本發明的目的，本發明提供一種人源化單克隆抗體，其輕鏈和重鏈可變區的氨基酸序列包括與SEQIDNO：1所示的氨基酸序列至少90％相同的輕鏈可變區(VL)氨基酸序列，優選地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的輕鏈可變區(VL)氨基酸序列，和與SEQIDNO：2所示的氨基酸序列至少90％相同的重鏈可變區(VH)氨基酸序列，優選地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的重鏈可變區(VL)氨基酸序列。所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列分別為：CDRL1(24位到39位氨基酸)：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQIDNO：3)，CDRL2(55位到61位氨基酸)：KVSNRFS(SEQIDNO：4)，CDRL3(94位到102位氨基酸)：FQSTHVPHT(SEQIDNO：5)，所述人源化單克隆抗體的重鏈可變區CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列分別為：CDRH1(31位到35位氨基酸)：DFSMN(SEQIDNO：6)，CDRH2(50位到66位氨基酸)：WINTETGEPTYADDFKG(SEQIDNO：7)，CDRH3(99位到101位氨基酸)：IDY(SEQIDNO：8)。所述人源化單克隆抗體的輕鏈可變區的骨架區FRL1、FRL2、FRL3和FR4的氨基酸序列分別為：FRL1的1位到23位氨基酸：DaVMTQSPLSLPVTPGEPASISC，其中氨基酸a代表I或V(SEQIDNO：9)；FRL2的40位到54位氨基酸：WYLQKPGQSPQLLIY(SEQIDNO：10)；FRL3的62位到93位氨基酸：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbC，其中氨基酸b代表Y或F(SEQIDNO：11)；FRL3的103位到113位氨基酸：FGQGTKLEIKR(SEQIDNO：12)；和/或所述人源化單克隆抗體的重鏈可變區的骨架區FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列分別為：FRH1的1位到30位氨基酸：cdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFT，其中氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P(SEQIDNO：13)；FRH2的36位到54位氨基酸：WVRQAPGQGLfWMG，其中氨基酸f代表E或K(SEQIDNO：14)；FRH3的67位到98位氨基酸：RFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkR，其中氨基酸g代表V或A，氨基酸h代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V(SEQIDNO：15)；FRH4的102位到112位氨基酸：WGQGTTVTVSS(SEQIDNO：16)。本發明還提供一種抗DR5胞外區的人源化單克隆抗體的制備方法，該人源化單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區的氨基酸序列包括SEQIDNO：1的輕鏈可變區(VL)的氨基酸序列和SEQIDNO：2的重鏈可變區(VH)的氨基酸序列，其輕鏈恒定區為人抗體的κ鏈，重鏈恒定區亞型為人IgG1。該制備方法包括以下步驟：通過PCR和合成引物拼接PCR分別得到人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區cDNA片段，利用同源重組將所得到的可變區cDNA片段通過同源重組到pCP載體中，分別與人IgG1重鏈恒定區和κ鏈連接后，再用重疊PCR將人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈相連接，并在重鏈和輕鏈之間加入具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列。以pcDNA3為原始載體，將上述人源化單克隆抗體的基因克隆到此載體，構建一個新的含有CAG啟動子和dhff篩選標記的抗人DR5人源化單克隆抗體的真核表達載體。本發明獲得的新的表達載體，含有具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列，并將人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈連接在一個開放閱讀框內。具體而言，所述真核表達載體帶有CAG強啟動子和dhff篩選標記、來自鼠抗人DR5的單克隆抗體(AD5-10)的重鏈互補決定區和輕鏈互補決定區與來自人源抗體的重鏈骨架區和輕鏈骨架區分別組成的重鏈可變區和輕鏈可變區的編碼序列、人源IgG1重鏈恒定區和輕鏈恒定區κ鏈的編碼序列、以及在重鏈和輕鏈之間加入的具有自我剪切功能的Furin/2A肽的編碼序列，被有效地連接以高效表達所述的人源化單克隆抗體。優選地，所述鼠抗人DR5的單克隆抗體為AD5-10(GuoYetal.，Anovelanti-humanDR5monoclonalantibodywithtumoricidalactivityinducescaspase-dependentandcaspase-independentcelldeath.JBiolChem2005；280(51)：41940-52；WO2006/017961，ZL200410070093.1)。優選地，來自鼠抗人DR5的單克隆抗體AD5-10的重鏈互補決定區和輕鏈互補決定區與來自人源抗體的重鏈骨架區和輕鏈骨架區分別組成的重鏈可變區和輕鏈可變區的編碼序列、人IgG1重鏈恒定區和輕鏈恒定區κ鏈、以及在重鏈(H)和輕鏈(L)之間加入的具有自我剪切功能的Furin/2A肽(F2A)連接起來的核苷酸序列編碼的氨基酸序列(HF2AL)為：GSMEFGLSWLFLVAILKGVQCcdQLVQSGeELKKPGASVKVSCKASGYTFTDFSMNWVRQAPGQGLfWMGWINTETGEPTYADDFKGRFghSiDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYjCkRIDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRKRRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDaVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYbCFQSTHVPHTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECZLE(SEQIDNO：17),其中：斜體的氨基酸序列為F2A，F2A之前的序列為該人源化單克隆抗體的重鏈，F2A之后的序列為該人源化單克隆抗體的輕鏈；氨基酸a代表I或V，氨基酸b代表Y或F，氨基酸c代表Q或E，氨基酸d代表V或I，氨基酸e代表S或P，氨基酸f代表E或K，氨基酸g代表V或A，氨基酸代表F或L，氨基酸i代表L或M，氨基酸j代表Y或F，氨基酸k代表A或V。對于上述氨基酸a到k的可選項，其分別代表的是相應的人源抗體的氨基酸或者回復突變回的鼠源抗體的氨基酸。由于這些可選項本身就是抗體框架區的組成氨基酸，因此，雖然由這些可選氨基酸組成的抗體可能會存在活性和/或抗原性的某些差別，但均是本發明所述的抗人DR5人源化單克隆抗體，相互之間無實質性的差別。用抗DR5人源化單克隆抗體的真核表達載體轉染HEK293細胞，經親和層析純化獲得完整的、具有殺傷多種腫瘤細胞活性的抗人DR5人源化單克隆抗體，命名為zaptuzumab。該人源化單克隆抗體和DR5的天然配體TRAIL均可與DR5結合，但其結合位點不同。體外研究表明，該抗DR5人源化單克隆抗體可殺死白血病、肝癌、結腸癌和肺癌等多種腫瘤細胞，殺傷活性呈時間和劑量依賴關系。由于該人源化單克隆抗體通過與DR5結合而發揮其功能，因此，在本發明實施例中證明了其能殺死上述種類的腫瘤細胞后，有理由相信同樣高表達DR5的其它惡性腫瘤細胞也可以被殺死，繼而實現治療相應的惡性腫瘤的目的。所述抗DR5人源化單克隆抗體誘導細胞凋亡和自噬性死亡兩種不同的細胞死亡形式。體內的研究表明，該抗DR5人源化單克隆抗體能強烈地抑制人結腸癌、肝癌和肺癌等腫瘤細胞在裸鼠體內生長，并且能與TRAIL或表柔比星等抗腫瘤藥物聯合應用，達到更好的治療效果。停藥后未見明顯的反彈現象。組織學分析未見引起小鼠肝臟和腎臟等器官病理性變化。本發明產生的抗DR5人源化單克隆抗體與TRAIL或表柔比星等抗腫瘤藥物的組合具有協同殺傷多種腫瘤細胞的作用。本發明還提供本發明所述的人源化單克隆抗體在制備治療腫瘤藥物中的用途。最后，本發明還提供一種所述的人源化單克隆抗體或其至少具有80％同源性的抗體，優選地，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的抗體與藥學上可接受的載體重組后獲得的重組表達載體在制備治療腫瘤的抗體基因治療藥物中的應用。由此可見，在本發明中，采用基因工程等現代生物學技術和方法，制備了抗人DR5的人源化單克隆抗體及其真核表載體，進而，將此表達載體轉染HEK293細胞，能夠大量地表達一種新型的抗DR5的人源化單克隆抗體。在體外，該人源化單克隆抗體具有強烈誘導多種腫瘤細胞凋亡的能力；在體內，該人源化單克隆抗體具有顯著抑制人移植瘤細胞在裸鼠體內形成腫瘤和抑制人移植瘤生長的生物學活性；該人源化單克隆抗體可與其它抗癌藥物聯用，在體內外誘導腫瘤細胞死亡，加強化療藥物的療效，降低化療藥物的劑量和毒副作用。因此，該人源化單克隆抗體在新型抗腫瘤藥物研制與應用中具有重要意義。本發明的優點與效果是獲得了前人沒有報道的抗DR5人源化單克隆抗體及其真核表達載體。在所述真核表達載體中，所述人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈被連接在一個開放閱讀框內，能夠同時、均衡、匹配地表達人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈，并自動組裝成功能完整的人源化單克隆抗體分子。該人源化單克隆抗體同DR5結合的位點與TRAIL與DR5結合的位點不同，可與TRAIL及表柔比星等抗腫瘤藥物聯合作用，協同增強其抗腫瘤的效果。在體外可誘導多種腫瘤細胞凋亡，但對正常細胞無毒副作用。在體內具有強烈的抑制人移植瘤形成和生長的抗腫瘤活性，對正常小鼠的肝臟和腎臟等器官無毒副作用。顯示該人源化單克隆抗體可發展為安全、有效的抗腫瘤藥物。以編碼該人源化單克隆抗體或進一步的人源化改型抗體的核苷酸序列與藥學上可接受的載體重組連接獲得的重組表達載體也可用于制備治療腫瘤的抗體基因治療藥物。抗DR5人源化單克隆抗體是利用基因工程技術將鼠源性抗DR5抗體的可變區與人抗體的恒定區相連接，構建成完整的人源化單克隆抗體，可以在保持原單抗特異性和親和力的基礎上，減少人抗鼠抗體反應，延長其半衰期和改善藥代動力學特性，并能有效地活化補體和Fc受體相關的免疫應答。本發明在已制備的一株鼠源功能性抗人DR5單克隆抗體(AD5-10)基礎上，通過CDR移植策略建立了人源化單克隆抗體，該抗體在體內外對多種腫瘤細胞具有特異性的凋亡誘導活性，對正常細胞和組織沒有毒副作用，可單獨或與TRAIL或其它抗腫瘤藥物聯用，用于多種腫瘤和與DR5高表達相關的其他疾病的治療。附圖說明圖1：是帶有CAG啟動子和dhfr篩選標記的抗DR5人源化單克隆抗體的真核表達載體結構圖。ADHFL(1692)表示抗DR5人源化單克隆抗體的重鏈、Furin/2A肽和輕鏈的編碼核苷酸序列。圖2：是該人源化單克隆抗體的真核表達載體轉染HEK293細胞后，細胞培養上清經親和層析純化獲得的抗DR5人源化單克隆抗體的SDS-PAGE分析結果。圖3：是使用Biacore系統和CM5芯片測定AD10、AD14和AD15三株該人源化單克隆抗體與其抗原DR5的親和力。A圖的四幅圖(從左到右，從上往下)分別對應AD10、AD14、AD15和AD5-10與其抗原DR5親和力的Biacore測定圖譜。B圖是根據A圖計算出的相應親和力。圖4：是采用CCK-8細胞毒檢測試劑盒測定該人源化單克隆抗體在體外殺傷腫瘤細胞的活性。顯示以不同濃度的該人源化單克隆抗體AD10、AD14和AD15處理人T淋巴細胞白血病細胞Jurkat、肝癌細胞BEL-7402、肺癌細胞H460和結腸癌細胞HCT11624小時的細胞存活率。具體實施方式下面通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的范圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。實施例實驗例1人源化抗體的設計與高效表達抗DR5人源化單克隆抗體的真核表達載體構建與結果鼠源的AD5-10單克隆抗體(中國專利申請號200410070093.1)的重鏈和輕鏈可變區的CDR片段用Kabatnumberingsystem(http：//www.bioinf.org.uk/abs/#kabatnum)找出并標注。重鏈和輕鏈可變區CDR片段的規范(canonical)結構預測根據文獻(1，KontermannR，DübelS(2001)，HumanisingAntibodiesbyCDRGrafting，p579；2，HwangWY，AlmagroJCetal.，(2005)Methods，36∶35-42)進行，選擇具有相同規范結構的人抗體序列作為接受框架。人源化抗體重鏈的設計：將支撐CDR結構及VH/VL界面的氨基酸找出并回復到鼠源抗體序列。經過回復突變的序列與具有相同規范結構的所有人抗體進行比對，選出最相似的人抗體進行CDR移植。然后，與IMGT數據庫中所有該類抗體比對，盡量將特殊氨基酸突變成常見氨基酸，以降低免疫原性。N端的第一個氨基酸如果是Q，則改變成E。同時，對通過構建模型選定的關鍵氨基酸進行回復突變。確認人源化抗體序列沒有引進糖基化位點。人源化抗體的J區(J-region)選擇完全依據序列的相似程度。人源化抗體的輕鏈設計采用與上述相同的方法。抗體同源模建：分別用AD10-5的輕鏈和重鏈以及BLASTSEARCH來搜索PDB蛋白結構數據庫，尋找與其序列相似度最高的已知結構的人抗體。根據BLASTSEARCH的輸出結果和序列相似度，將1DLF、1I9J、1NQB和1PLG選作VL模建的模板。將1IAL、1NLB、1A4K和1FJ1選為VH的模板，利用Schrodinger軟件包分別對VH和VL做同源模建，分別獲得輕鏈和重鏈的結構模型。再利用CCP4軟件包中的contact程序來對結構模型進行分析，列出與CDRloop有相互作用的輕鏈和重鏈框架區的氨基酸殘基。根據軟件分析的結果和人工檢視，發現框架區中的以下氨基酸殘基對于維持CDRloop的空間構象較為重要，它們是：輕鏈的D60、D70、Y49、F71、M4和V2；重鏈的K46、W47、M48、F67、L69、M71、W102和I2。所設計的人源化抗體的重鏈、Furin/2A肽和輕鏈的氨基酸序列(如SEQIDNO：17所示)。經優選設計的3個人源化抗體AD10、AD14和AD15重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO：18和19、SEQIDNO：20和21、SEQIDNO：22和23所示。以pcDNA3(Invitrogen，A-150228)為原始載體，以pAM/CAG載體(香港大學提供)為模板，以上游引物5’GGCGCAGATCTATTGACGTCAAT3’(SEQIDNO：24)和下游引物5’GGCAAGCTTAATTCTTTGCCAAAATG3’(SEQIDNO：25)擴增CAG啟動子序列(amodifiedcytomegalovirusimmediateearlyenhancerandachickenbeta-actinpromoter)。以pSV2-dhfr載體DNA(購自ATCC，67110)為模版，以上游引物5’AATCCCGGGACAGCTCAGGGCTGCG3’(SEQIDNO：26)和下游引物5’GGCGGCGCTTCGAAAAAGCCAGCAAAAGCTC3’(SEQIDNO：27)擴增二氫葉酸還原酶(dhfr)基因片段。通過拼接PCR擴增或化學合成人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區cDNA片段，利用同源重組技術將得到的可變區cDNA片段整合到線性化的帶有人IgG1重鏈恒定區的通用序列的pCP載體(上海睿智化學有限公司提供)中。利用PCR擴增自我剪切位點Furin/2A肽編碼序列(F2A)(引物1：5’CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAGGAAGAGGCGAGCACCTGT3’(SEQIDNO：28)，引物2：5’GCCCAGCAGCTGGGCGGGCACGCGCATGTCGGGCCCAGGATTGGACTCA3’(SEQIDNO：29)并插入上述獲得的重組質粒中人源化單克隆抗體的重鏈和輕鏈編碼核苷酸序列之間，從而依次將CAG、該人源化抗體重鏈(H)、Furin/2A肽(F2A)、該人源化抗體輕鏈(L)的編碼核苷酸序列(表示為HF2AL)和編碼dhfr的核苷酸序列組成一個開放閱讀框(openreadingframe，OPF)。將上述獲得的編碼OPF核苷酸序列插入原始載體pcDNA3，經測序鑒定正確，獲得新的抗DR5的人源化單克隆抗體的真核表達載體(命名為pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr)。所獲得的重組表達質粒的圖譜如附圖1所示。實驗例2抗DR5人源化單克隆抗體的表達與純化用脂質體轉染法將構建的真核表達載體pcDNA3-CAG-HF2AL-dhfr轉染HEK293細胞(購自ATCC，CRL-9096)，于37℃、5％CO2、120rpm/min振蕩培養，使抗DR5人源化單克隆抗體在HEK293真核細胞中表達并分泌到細胞培養液中。轉染的細胞培養到細胞活力小于60％時(約需6天)，收集細胞培養上清。制備1mlProteinA親和層析柱，先用PBS磷酸緩沖液(20mM磷酸鹽、300mM氯化鈉，pH7.0)平衡，然后加入收集的細胞培養上清，用PBS磷酸緩沖液洗滌，用100mM的檸檬酸(pH3.0)洗脫。收集的洗脫液立即用1M的Tris-HCl(pH9.0)調節到pH8.0，并對PBS緩沖液透析過夜。以SDS-PAGE分析其中的抗DR5人源化單克隆抗體的純度與分子量，結果見附圖2。實驗例3抗DR5人源化單克隆抗體與其抗原DR5結合親和力的測定在BiacoreX100系統(GEHealthcare，Uppsala，瑞典)使用的CM5芯片(GEHealthcare，BR-1000-14)上選定空白對照通道和樣品通道。首先用按1∶1混合的50mMN-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)：200mM碳化二亞胺[1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide，EDC]以10μl/min的速度注入空白對照通道和樣品通道7分鐘，進行芯片活化。以5μl/min的速度注入溶在pH5.5醋酸鈉溶液中的抗原DR5(45μg/ml)，包被芯片，直至獲得目標值680Ru的信號。將1M乙醇胺以10μl/min的速度注入7分鐘，封閉芯片上多余的結合位點。結合動力學測試選用HBS-EP(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005％SurfactantP20)緩沖液，將純化的該人源化單克隆抗體AD10、AD14和AD15稀釋為不同濃度，分別以30μl/min的速度注入空白通道和樣品通道3分鐘。將HBS-EP緩沖液以30μl/min的速度注入5min，進行解離。采用BiacoreX100evaluation2.0軟件進行數據分析和處理，結果見附圖3的A圖和B圖。結果表明該人源化單克隆抗體保留了親本鼠源抗人DR5單克隆抗體(AD5-10)的抗原親和力。實驗例4抗人DR5人源化單克隆抗體殺傷腫瘤細胞的活性測定在96孔細胞培養板中進行。在生長至對數生長期的人T淋巴細胞白血病細胞Jurkat(ATCC，TIB-152)、結腸癌細胞HCT116(ATCC，CCL-247)、肝癌細胞BEL-7402(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，TCHu10)和非小細胞肺癌細胞H460(ATCC，HTB-177)中，分別加入不同濃度(0、0.5、1、2、4、8μg/ml)的該抗人DR5人源化單克隆抗體AD10、AD14和AD15，處理24小時，以親本鼠源抗人DR5單克隆抗體(AD5-10)及其人-鼠嵌合抗體zaptuximab為對照。按照CCK-8細胞毒檢測試劑盒(Dojindo，Gaithersburg，MD)操作規程，加入CCK-8試劑，反應2-4小時，在微型酶標板測定儀波長450nm處測定OD值。以無細胞孔的OD值為空白對照“0”。細胞存活率＝處理孔的OD值/未處理孔OD值，結果見附圖4。結果表明上述人源化單克隆抗體具有顯著的腫瘤細胞殺傷活性。本領域技術人員知曉，在不改變本發明所述人源化單克隆抗體的親和性和生物活性的前提下，本發明所公開的所述人源化單克隆抗體的具體序列可以被進行適當的改變。例如，所述序列中的部分氨基酸殘基可以被刪除、添加和替換而不改變所述序列的親和性和生物活性。例如，本發明所述CDR和FR區的部分氨基酸殘基可以被性質類似的氨基酸所替換而不影響其親和性和生物活性。所述人源化單克隆抗體的編碼序列可根據其宿主的密碼子偏愛性的不同而進行相應的替換。