部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針及其制備方法，屬于納米技術領域。
【背景技術】
[0002]石墨烯(graphene)是緊密堆積成二維蜂窩狀晶格結構的雜化單層碳原子晶體，厚度僅0.335 nm，是目前世上最薄卻也是最堅硬的納米材料。石墨經過氧化剝離而得的衍生物-氧化石墨稀(graphene oxide, GO)，其表面有大量的輕基、羧基、羰基等含氧基團，這些官能團的存在使得氧化石墨烯具有極好的親水性，能在水溶液體系中形成穩定的膠束溶液，同時具有良好的化學可修飾性，常被用作生物傳感研究中識別元件的載體。
[0003]熒光共振能量轉移是能量由供體熒光團經無輻射途徑轉移給受體熒光團，并引起供體熒光猝滅和受體熒光增強的光學現象。近年來，人們致力于開發基于氧化石墨烯熒光淬滅效應的熒光共振能量轉移傳感器，并將其用于生物及化學檢測。研究表明，氧化石墨烯與單鏈DNA(ssDNA)具有較強的吸附作用而對雙鏈DNA(dsDNA)的吸附能力較弱。熒光分子修飾的ssDNA可吸附在氧化石墨烯表面，通過熒光共振能量轉移引起熒光淬滅。若熒光分子修飾的ssDNA與其互補鏈雜交形成雙鏈后則不能被氧化石墨烯吸附，從而保持熒光特性。與其它有機猝滅劑相比，氧化石墨烯不僅有較高的猝滅效率、信噪比，而且擁有納米材料所特有的優點，可保護其表面修飾的生物分子穩定性，阻止酶切，在DNA、RNA、蛋白質、重金屬離子及小分子物質的檢測方面具有廣闊的應用前景。
[0004]本發明提供了一種部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針及其制備的新方法。部分還原氧化石墨烯通過氧化石墨烯在堿性溶液中的室溫控制還原得到，在保持水溶液體系穩定性的基礎上，有效增加了 sp2雜化晶域，對熒光分子修飾ssDNA的熒光猝滅效率和猝滅速度均大幅度提高，是一種理想的熒光共振能量轉移納米探針。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針及制備方法。
[0006]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:一種部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針，其特征是片層厚度為1.1 ηπι，2θ (001)為10.86°?11.10°，2Θ
(002)為22.10。-22.66。，C/0比值為0.49-0.53，碳碳鍵比例為34.22%?52.46%，能猝滅熒光分子修飾單鏈DNA的熒光。
[0007]所述熒光猝滅效應隨著碳碳鍵比例的增加而增強。
[0008]在15yL濃度為100 yg/mL的部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針，加入40 口口農度為500 nmol/L的6-羧基熒光素修飾ssDNA和445 yL 10 mmol/L、pH 8.0的含50mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA的Tris-HCl緩沖液，室溫反應30秒，熒光猝滅率為44.5?99.3%ο
[0009]本發明所述的一種部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針的制備方法，其特征是將氧化石墨烯水溶液與NaOH水溶液等體積混合，室溫反應后，離心水洗，沉淀恒溫干燥，得到部分還原氧化石墨烯固體，將部分還原氧化石墨烯固體加水超聲剝離得穩定的部分還原氧化石墨烯水溶液。
[0010]上述所使用的氧化石墨烯制備方法為:將鱗片石墨加入到濃硫酸和磷酸的混合溶液中，充分攪拌后，置于在0 °C冰浴中，將高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中，保持0 °C冰浴，磁力攪拌后，將所得墨綠混懸液轉移到溫水浴中獲得墨綠混懸液，然后將所得墨綠混懸液轉移至溫水浴中，反應獲得紫黑色混懸液，將冰水緩慢加入到得到的紫黑色混懸液中，劇烈攪拌獲得溶液，繼而往溶液中逐滴滴加過氧化氫溶液，溶液顏色突變為亮黃色，攪拌后所得溶液經孔徑20-30微米的G1砂芯漏斗過濾，繼而離心分離，棄去上清液;沉淀物中加入雙蒸水充分振蕩洗滌，離心分離，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色;再加入鹽酸充分振蕩洗滌，經孔徑20-30微米的G1砂芯漏斗過濾去除不溶顆粒，濾液離心分離，棄去上清液，沉淀顏色繼續加深;接著用無水乙醇將沉淀物洗至pH值為中性，離心分離，棄去上清液，沉淀呈棕黃色；最后用乙醚沖洗沉淀，經孔徑1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗過濾，濾餅在室溫下過夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。
[0011 ] 所述NaOH水溶液的濃度為20 mmol/L?10 mmol/L。
[0012]所述反應時間為0.5?2小時。
[0013]所述恒溫干燥溫度為50?60 °C，干燥時間為6?12小時。
[0014]上述所使用的氧化石墨烯制備方法為:稱取325目鱗片石墨2.7g，加入到316 mL濃度為18.4 mol/L的濃硫酸和36 mL濃度為14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中，充分攪拌后，置于在0 °C冰浴中，將16.2 g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中，保持0 1冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠混懸液轉移至35 1溫水浴中，控溫1小時，然后將所得墨綠混懸液轉移至50 1溫水浴中，控溫12小時，360 mL冰水緩慢加入到得到的紫黑色混懸液混合物中，劇烈攪拌1小時，繼而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%過氧化氫溶液，溶液顏色突變為亮黃色，攪拌30分鐘，所得溶液經孔徑20-30微米的G1砂芯漏斗過濾，繼而4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液;加入180 mL雙蒸水充分振蕩洗滌，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色;再加入180 mL 30wt%鹽酸充分振蕩洗滌，經孔徑20-30微米的G1砂芯漏斗過濾去除不溶顆粒，濾液4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色繼續加深;接著多次用無水乙醇將沉淀物洗至pH值為中性，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀呈棕黃色;最后用乙醚沖洗沉淀，經孔徑1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗過濾，濾餅在室溫下過夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。
[0015]本發明的具體技術方案為:
(一)氧化石墨烯的制備
稱取325目鱗片石墨，加入到體積比為9:1的濃硫酸和磷酸混合溶液中。充分攪拌后，置于在0 °C冰浴中。將高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 °C冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠混懸液轉移至35 1溫水浴中，控溫1小時，然后再將混懸液轉移至50 1溫水浴中，控溫12小時。將一定量的冰水混合物緩慢加入到得到的紫黑色混懸液中，劇烈攪拌1小時。繼而往溶液中逐滴滴加30%過氧化氫溶液，至溶液顏色突變為亮黃色。所得溶液經G1砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾，繼而4000轉/分鐘離心30分鐘，分別經過水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚沖洗后經G5砂芯漏斗(孔徑1.5-2.5微米)過濾。濾餅在室溫下過夜晾干，得到氧化石墨。
[0016](二)部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉移納米探針的制備
將4 mg/mL上述方法制備的氧化石墨稀水溶液分別與20 mmol/L,2 mmol/L和10 mmol/L的NaOH水溶液等體積混合，室溫條件下攪拌反應2小時，12000轉/分鐘離心30分鐘，并用水洗滌至中性。最后置于恒溫干燥箱50 °C干燥12小時，即可得到不同還原程度的部分還原氧化石墨稀固體(以pRG0i，pRG02和pRG03表示三種不同還原程度的部分還原氧化石墨稀固體)。
[0017]本發明的優點:
(1)本發明在溫和的化學反應條件下合成部分還原氧化石墨烯。制備方法綠色環保，操作簡便快捷，重現性好。
[0018](2)本發明所制備的部分還原的氧化石墨烯具有較大的sp2雜化區域，較少的表面缺陷及良好的分散性和穩定性。
[0019](3)本發明所制備的部分還原的氧化石墨烯可作為高效熒光共振能量轉移納米探針。
【附圖說明】
[0020]圖1為G0、pRG01、pRG02和pRG03水溶液的外觀圖。
[0021 ]圖2為G0和pRG03的原子力顯微鏡圖，圖中:a為GO，b為pRG03，(3為60的片層厚度曲線，d為pRG03的片層厚度曲線。
[0022]圖3為GCKpRGOhpRGO〗和pRG03的X射線衍射圖。
[0023]圖4為GCKpRGO^pRGO:?和pRG03的拉曼光譜圖。
[0024]圖5為GO、pRGO1、pRG02和pRG03的X光射線電子能譜的比較圖，圖中:A為GO，B為pRGOi, C為pRG02, D為pRG03。
[0025]圖6為GO'pRGO^pRGO^pRGOs分別與6-羧基熒光素修飾的ssDNA室溫反應30秒后的熒光光譜(激發波長494 nm)0
[0026]圖7為熒光猝滅率與碳碳鍵比例的關系圖。
【具體實施方式】
[0027]實例1:
稱取325目鱗片石墨2.7 g，加入到316 mL濃度為18.4 mol/L的濃硫酸和36 mL濃度為14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分攪拌后，置于在0 °C冰浴中。將16.2 g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 °C冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠混懸液轉移至35 1溫水浴中，控溫1小時，然后將所得墨綠混懸液轉移至50 1溫水浴中，控溫12小時。360 mL冰水緩慢加入到得到的紫黑色混懸液中，劇烈攪拌1小時。繼而往溶液中逐滴滴加12 mL 30 wt %過氧化氫溶液，溶液顏色突變為亮黃色，攪拌30分鐘。所得溶液經G1砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾，繼而4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液;加入180 mL雙蒸水充分振蕩洗滌，4000轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入180 mL 30 wt %鹽酸充分振蕩洗滌，經G1砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾去除不溶