本發明涉及一種腐植酸鉀的制備方法。
背景技術：
：海藻中不但含有植物所需的大量元素、微量元素和多種礦物質，而且含有陸生植物少有的海藻酸以及天然植物生長調節物質等有效成分，以海藻為原料經過特殊生化工藝處理，提取并保留海藻天然活性成分，精煉濃縮而形成海藻肥料具有提高作物產量和品質，抵抗病蟲害及不良環境以及改良土壤保持水土的功效，其應用于農業生產有巨大的市場需求和良好的發展前景。決定海藻肥質量的一個關鍵因素是提取工藝。不同的提取工藝對海藻肥活性成分的種類和含量影響巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化學法、物理法以及生物法。化學法主要是利用酸、堿及有機溶劑處理海藻細胞，使細胞消解或內源物質增溶，該方法操作簡單，容易實現，也是國內外絕大多數海藻肥生產企業采用的方法。但是，化學試劑對海藻細胞內的活性物質成分的破壞是相當大的，并且殘留的有機試劑對環境也是潛在的危害。物理法的原理是控制壓力，溫度等物理環境條件，利用機械力使海藻細胞破碎，內容物釋放。該方法雖然工藝清潔、環境友好，但是對于儀器設備的要求嚴苛，反應條件變化劇烈，成本較高，難以實現大規模生產。生物法包括酶法降解和微生物發酵兩種方法，其主要原理是破壞海藻細胞壁結構并降解大分子物質為植物容易吸收利用的小分子物質，該方法反應溫和，產物多元化，整個生產過程安全環保無污染，是理想的海藻肥生產方法。利用微生物發酵法生產海藻肥料的研究相對較少，僅有的幾例研究是選用多種微生物對海藻原料進行類似堆肥發酵或好氧發酵處理，存在發酵過程可控性差，發酵周期長，目標產物不明確等問題，難以滿足工業化生產要求的統一，穩定，可控的標準，產品的質量難以保障。腐植酸是動植物遺骸經過微生物的分解和轉化，以及地球化學的一系列過程積累起來的一類有機物質。腐植酸廣泛存在于泥炭、褐煤、風化煤中，其主要元素組成為碳、氫、氧、氮、硫和少量的磷。腐植酸類物質具有改良土壤理化性能、提高肥料利用效率、刺激作物生長、增強作物抗逆性、改善農產品品質的功能。腐植酸鉀采用天然含腐植酸的風化煤經化學提煉而成，它是多功能的高分子化合物，含有羥基，醌基，羧基等較多的活性基團，具有很大的內表面積，有較強的吸附，交換，絡合，螯合能力。在農業中作為復合肥料，可改變土壤結構，對農作物起到防病抗病增產增收的效果。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是，提供一種含海藻活性成分的腐植酸鉀的制備方法，制備過程穩定可控，發酵周期短，產物功效顯著，適于規模化生產。該方法將海藻中活性成分與肥料、腐植酸鉀結合，可提高作物抗病、抗逆性，提高作物產量。本發明生產的腐植酸鉀水溶性好，質量穩定，水不溶物小于0.5%，水溶性腐植酸含量大于70%，可以用作多種水溶性肥料的原料。為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：一種含海藻活性成分的腐植酸鉀的制備方法，其特征在于按照以下步驟進行：1）、制備海藻粉末：將烘干后的海藻磨成粉末；2）、制備產品A和種子液：將海藻粉末與水按照質量比1～10:100分別裝入發酵罐中，在100～150℃條件下滅菌15～35min，得到產品A；將巨大芽孢桿菌活化與擴培，制備巨大芽孢桿菌種子液X；將嗜糖芽孢桿菌活化與擴培，制備嗜糖芽孢桿菌種子液Y；3）、制備產品B：將種子液X接種到產品A中，種子液X用量為產品A質量的1%～10%，發酵溫度為30～37℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為5～8，發酵時間為8～24h，得到產品B；4）、制備產品C：調整產品B的pH至4.0～5.5，發酵罐內溫度至0℃～5℃，保存2～5天，然后將溫度調整至20℃～35℃，得到產品C；5）、制備產品D：將種子液Y接種到產品C中，種子液Y用量為產品C質量的1%～10%，發酵溫度為30～34℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為5～8，發酵時間為8～24h，得到產品D；6）、制備產品E：調整產品D的pH至4.0～5.5，發酵罐內溫度至0℃～5℃，保存2～7天，然后將溫度調整至25℃～35℃，得到產品E；7）、制備海藻提取液：將產品E壓濾得到海藻渣及濾液，其中濾液為海藻提取液；8）、制備含腐植酸鉀的海藻提取液：將腐植酸原料和硫酸鉀分別加入海藻提取液中，腐植酸原料與海藻提取液固液比為2~5:10，硫酸鉀與海藻提取液固液比為1~2:10，用氫氧化鉀調整混合反應體系pH值至7.5~9.5；在1.5~2.0個標準大氣壓、58~62℃恒溫條件下，攪拌反應2~3h，過濾除渣得到含腐植酸鉀的海藻提取液；9）、制備含海藻活性成分的腐植酸鉀：含腐植酸鉀的海藻提取液經濃縮、干燥、粉碎之后得到含海藻活性成分的腐植酸鉀。步驟2）中巨大芽孢桿菌的活化與擴培：液體培養基按照以下質量比配成：羧甲基纖維素鈉10份、胰蛋白胨10份、磷酸氫二鉀3份、磷酸二氫鈉3份、氯化鐵3份、氯化鈉0.5份和蒸餾水1000份；巨大芽孢桿菌YIC～BM1和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為20h；步驟2）中嗜糖芽孢桿菌的活化與擴培：液體培養基按照以下質量比配成：海藻酸鈉5份、硫酸銨5份、硫酸鎂1份、磷酸氫二鉀2份、硫酸亞鐵0.01份和蒸餾水1000份；嗜糖芽孢桿菌接種至液體培養基中，嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為5:100，，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為20h。步驟2）中所述海藻粉末和水的質量比為4:100，滅菌溫度115℃，滅菌時間25min。步驟4）中，調整產品B的pH至5.0，發酵罐內溫度至5℃，保存3天，然后將溫度調整至20℃。步驟6）中，調整產品D的pH至5.0，發酵罐內溫度至5℃，保存3天，然后將溫度調整至25℃。所述的酸堿調節劑為檸檬酸，草酸，醋酸，磷酸氫二鉀，碳酸鈉，醋酸鈉中的一種或任意比例的兩種以上。所用的腐植酸原料是腐植酸含量大于50%的風化煤、褐煤，且粉碎至60-80目的煤粉。步驟1）中的海藻為銅藻、海帶、鼠尾藻和馬尾藻中的一種或者任意比例的兩種以上。所述巨大芽孢桿菌是巨大芽孢桿菌YIC～BM1，保藏號為CGMCCNo.12156。所述嗜糖芽孢桿菌是嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3，保藏號為CGMCCNo.12155。發明具有以下有益技術效果：本產品海藻活性成分采用生物提取，所得海藻成分破壞少，提取率高，產品中所含海藻酸能夠對土壤中重金屬起到鈍化作用，微生物降解產生的褐藻寡糖具有促生長與誘導植物抗逆的活性，能夠在植物生長調節與誘導植物抗逆領域發揮重要作用，此寡糖分子量較小，能夠在自然界中自行降解，不會對環境造成污染，而且此寡糖的有效劑量很低，適宜大范圍使用。本發明還具有以下特點：1、本發明采用巨大芽孢桿菌YIC～BM1以及嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3對海藻發酵，能夠破壞海藻細胞壁結構促使海藻體內更多營養物質得以釋放，嗜糖芽孢桿菌具有降解褐藻酸的能力，能夠降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易于植物吸收利用的營養成分，發酵過程穩定可控，發酵周期短，產物功效顯著，適于規模化生產。2、本發明采用復合菌種發酵，各類菌株發揮協同作用，效果肥效均明顯優于單一的菌種發酵，而且純生物發酵，保證了海藻活性成分不受破壞。3、本發明采用的復合菌種發酵不同于簡單的將不同的菌種種子液混合發酵，而是根據微生物的作用不同，按照先后次序依次分級發酵，避免了微生物菌群間的相互競爭拮抗，減少內耗，將各自菌群的作用發揮到最大化，保證了最好的效果。4、該產品將肥料、腐植酸鉀與海藻有效成分結合，在提高作物的抗逆性和抗病性方面有顯著效果，另外該產品全水溶，可以滿足現代農業需求。具體實施方式下面結合具體實例進一步說明本發明。實施例1將洗凈烘干后的新鮮鼠尾藻磨成50～60目粉末。海藻粉末與水按照質量比4:100裝入發酵罐中，在115℃條件下滅菌25min，得到產品A。并制備種子液：種子液X的制備實例：將產纖維素酶的巨大芽孢桿菌YIC～BM1接種至液體培養基，巨大芽孢桿菌YIC～BM1和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為20h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液X；種子液Y的制備實例：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3接種至液體培養基，嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為20h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液Y；將種子液X加入到產品A中，其中種子液X與產品A的質量比為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品B；調整產品B的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品的溫度至20℃，得到產品C；然后補充種子液Y，補充的種子液Y與產品C的質量比為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品D；調整產品D的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品D的溫度至25℃，得到產品E；將產品E壓濾后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液體比例20%的風化煤粉，10%的硫酸鉀，用氫氧化鉀調節pH至8.0，在1.5個標準大氣壓下攪拌反應2.5小時，經過濾濃縮干燥后粉碎即為本發明產品。所得腐植酸鉀產品：腐植酸含量為77.82%,K2O為13.55%，水不溶物為0.27%。實施例2將洗凈烘干后的新鮮銅藻磨成50～60目粉末；海藻粉末與水按照質量比4:100裝入發酵罐中，在115℃條件下滅菌25min，得到產品A。并制備種子液：種子液X的制備實例：將產纖維素酶的巨大芽孢桿菌YIC～BM1接種至液體培養基，巨大芽孢桿菌YIC～BM1和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液X；種子液Y的制備實例：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3接種至液體培養基，嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液Y；將種子液X加入到產品A中，其中種子液X與產品A的質量比為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品B；調整產品B的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品的溫度至20℃，得到產品C；然后補充種子液Y，補充的種子液Y與產品C的質量比為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品D；調整產品D的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品D的溫度至25℃，得到產品E；將產品E壓濾后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液體比例30%的風化煤粉，10%的硫酸鉀，用氫氧化鉀調節pH至8.5，在1.5個標準大氣壓下攪拌反應2.5小時，經過濾濃縮干燥后粉碎即為本發明產品。所得腐植酸鉀產品：腐植酸含量為79.66%,K2O為13.72%，水不溶物為0.25%。實施例3將洗凈烘干后的新鮮銅藻和新鮮馬尾藻按照質量比1:1復配，磨成50～60目粉末；海藻粉末與水按照質量比4:100裝入發酵罐中，在115℃條件下滅菌25min，得到產品A。并制備種子液：種子液X的制備實例：將產纖維素酶的巨大芽孢桿菌YIC～BM1接種至液體培養基，巨大芽孢桿菌YIC～BM1和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液X；種子液Y的制備實例：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3接種至液體培養基，嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液Y；將種子液X加入到產品A中，其中種子液X與產品A的質量比為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品B；調整產品B的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品的溫度至20℃，得到產品C；然后補充種子液Y，補充的種子液Y與產品C的質量比為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品D；調整產品D的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品D的溫度至25℃，得到產品E；將產品E壓濾后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液體比例40%的風化煤粉，15%的硫酸鉀，用氫氧化鉀調節pH至8.5，在1.5個標準大氣壓下攪拌反應2.5小時，經過濾濃縮干燥后粉碎即為本發明產品。所得腐植酸鉀產品：腐植酸含量為82.32%,K2O為13.93%，水不溶物為0.37%。實施例4將洗凈烘干后的海帶磨成50～60目粉末；海藻粉末與水按照質量比4:100裝入發酵罐中，在115℃條件下滅菌25min，得到產品A。并制備種子液：種子液X的制備實例：將產纖維素酶的巨大芽孢桿菌YIC～BM1接種至液體培養基，巨大芽孢桿菌YIC～BM1和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液X；種子液Y的制備實例：將嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3接種至液體培養基，嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3和培養基的體積比例為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h；活化之后按同樣操作步驟擴培，得到種子液Y；將種子液X加入到產品A中，其中種子液X與產品A的質量比為5:100，發酵溫度為32℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為6.5，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品B；調整產品B的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品的溫度至20℃，得到產品C；然后補充種子液Y，補充的種子液Y與產品C的質量比為5:100，發酵溫度為30℃，用酸堿調節劑調節反應的pH值為7.2，溶氧控制在20%，轉速為200r/min，通氣量在800L/min，發酵罐壓應維持在0.03Mpa，發酵時間為24h，得到產品D；調整產品D的pH至5.0，并以每小時3℃的溫度變化調整溫度溫度至5℃，保存3天，以每小時3℃的溫度變化調整產品D的溫度至25℃，得到產品E；將產品E壓濾后得到海藻提取液；向海藻提取液中加入液體比例50%的風化煤粉，20%的硫酸鉀，用氫氧化鉀調節pH至9.0，在1.5個標準大氣壓下攪拌反應3小時，經過濾濃縮干燥后粉碎即為本發明產品。所得腐植酸鉀產品：腐植酸含量為86.22%,K2O為14.25%，水不溶物為0.33%。上述實施例中所用富含腐植酸原料為腐植酸含量為52%的風化煤。本發明所述巨大芽孢桿菌YIC～BM1的保藏號為CGMCCNo.12156；保藏單位名稱是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分類命名為：Bacillusmegaterium。所述巨大芽孢桿菌YIC～BM1的生物特性如下：YIC～BM1菌株在纖維素培養基平板上生長48h后，菌落圓形，白色，表面平整。顯微鏡觀察菌株為革蘭氏陽性，桿狀，能運動，產芽孢。生長溫度范圍20～40℃，PH范圍6-10，NaCl濃度范圍0～20%，菌株最適生長溫度37℃，最適生長pH7.5。觸酶，氧化酶，半乳糖苷酶陽性，吲哚，VP實驗陰性，不還原硝酸；能夠利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根據其生理生化特征，基因序列及系統發育樹信息，將該菌株鑒定為巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium。本發明所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的保藏號為CGMCCNo.12155；保藏單位名稱是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分類命名為：Bacillushalosaccharovorans。所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的生物特性如下：YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生長48h后，菌落不規則，淡黃色，中間不透明，邊緣半透明，表面褶皺。顯微鏡觀察菌株為桿狀，在末端或近末端可產生芽孢，革蘭氏陽性，能運動，生長后期菌體易聚集成團。生長溫度范圍20～45℃，PH范圍6～9，NaCl濃度范圍0～15%，菌株最適生長溫度37℃，最適生長pH7.5。觸酶，氧化酶，VP試驗陽性，能夠利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纖維素。根據其生理生化特征，基因序列及系統發育樹信息，將該菌株鑒定為嗜糖芽孢桿菌Bacillushalosaccharovorans。生化特性結果生化特性結果觸酶+乳糖～氧化酶+半乳糖～VP試驗+淀粉～葡萄糖+山梨醇～甘露糖+維生素～甘露醇+果糖+注：+表示可以利用，～表示不能利用。當前第1頁1 2 3