本發明屬于生物肥料技術領域，涉及一種復合固氮微生物菌肥及其制備方法。
背景技術：
固氮菌類肥料是指以土壤或作物根際生活，并固定空氣中氮氣的微生物菌種，用液體深層發酵而制成的活體制品，能夠固定空氣中的氮元素作為養料，并能分泌生長素物質，幫助作物生長，在自然界中，每年由微生物所固定的氮素約1億多噸，對增加土壤肥力起著很大作用。研究結果顯示施用固氮菌肥料后能有促進植物生長的趨勢，并伴有一定的增產效應，但效果不穩定，主要原因是固氮菌在儲運過程中，活菌數下降，施入土壤后，受土壤環境影響，活菌數及活性也會下降，效果得不到保證；
現階段，主要使用的固氮菌為棕色固氮菌，圓褐固氮菌，光合細菌等非芽孢類的固氮菌，其不容易保存，不易于商品化。而且這些菌種一般在偏酸性環境中生長發育不良。而且大部分為單一菌種，其適應環境的能力有限。
技術實現要素：
本發明提供一種適用PH范圍廣，好氧與厭氧條件下都具有較強固氮能力的，易保存的復合固氮微生物菌肥，該復合固氮微生物菌肥的原料配比為：彎曲芽孢桿菌發酵液10-30份，巴氏梭菌發酵液30-80份，印度拜葉林克氏菌發酵液20-60份。
本發明的第二目的在于提供一種復合固氮微生物菌肥的制備方法，該方法步驟簡單，確保微生物菌肥的肥效突出。
為了達到上述目的，該復合固氮微生物菌肥的制備方法，包括以下步驟：
步驟一，彎曲芽孢桿菌發酵液的制備
取出彎曲芽孢桿菌保藏管，用無氮固體培養基分別劃平板進行復蘇，30℃培養96小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有無氮固體培養基，在30℃培養箱中培養72小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L彎曲芽孢桿菌發酵培養基的500L發酵罐中，開攪拌200r/min，前8小時通氣量為100L/min，8-24小時后通氣量為200L/min ，24小時后通氣量為360L/min ，30℃培養40-60小時，檢測其芽孢含量超過50億CFU/ml，即作為彎曲芽孢桿菌發酵液；
其中，所述無氮固體培養基：蔗糖10g，磷酸氫二鉀0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，硫酸鈣0.1g，碳酸鈣5g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH7.2；
其中，所述彎曲芽孢桿菌發酵培養基：糖蜜40g/L，玉米淀粉10 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，硫酸錳0.3g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，碳酸鈣10 g/L， pH7.0；各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
步驟二，巴氏梭菌發酵液的制備
取-80℃甘油管保藏的菌種1mL接種于裝有9mLRCM培養基的試管中，37℃條件下靜態厭氧活化48h。將活化好的菌種按1%(v/v)的接種量轉接到滅過菌的100L巴氏梭菌種子培養基中。37℃條件下靜態厭氧培養24h~36h，菌含量超過5億CFU/ml，即可作為巴氏梭菌種子繼續接種。將100L巴氏梭菌菌種子接至裝有900L已經滅菌的巴氏梭菌發酵培養基的1噸的發酵罐中，抽真空，37℃培養8-10天，待巴氏梭菌產生芽孢，芽孢含量超過50億CFU/ ml，即可停止培養，即為巴氏梭菌發酵液；
其中，所述的RCM培養基：胰蛋白陳10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5克/L，醋酸鈉3g/L，pH7.0，121℃滅菌20min；
其中，所述的巴氏梭菌種子培養基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸鎂1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃滅菌20min；
其中，所述的巴氏梭菌發酵培養基：大米粉40g/L，酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸鎂1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖5g/L， PH7.0，121℃滅菌20min。
步驟三，印度拜葉林克氏菌發酵液的制備
取出印度拜葉林克氏菌菌種保藏管，用印度拜葉林克氏菌固體培養基分別劃平板進行復蘇，30℃培養120小時。在平板下挑取單個菌落接種50毫升印度拜葉林克氏菌液體培養基中，在培養箱中30℃震蕩培養96小時。種子采用10%的接種量，接種至5L大三角瓶中，裝液量為2L，二級無氮液體種子培養基，30℃震蕩培養96-120小時，檢測其菌液濃度，活菌含量超過5億cfu/ml，即可作為印度拜葉林克氏菌液體菌種接種至裝有600L印度拜葉林克氏菌發酵培養基的1000L發酵罐中，接種量為10%，開攪拌120r/min，前24小時通氣量為200L/min，24小時后通氣量為480L/min ，30℃培養40-70小時，檢測其菌體含量不低于60億cfu/ml，即可結束發酵，即得到印度拜葉林克氏菌發酵液；
其中，所述印度拜葉林克氏菌固體培養基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，水洗瓊脂20 g，蒸餾水1.0L，pH 7.2；
其中，所述印度拜葉林克氏菌液體培養基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，蒸餾水1.0L，pH 7.2；
其中，所述二級無氮液體種子培養基：蔗糖20g，蘋果酸5.0g, K2HPO4.H2O 0.lg,KH2PO4 .H20 0.4g，MgS04.7H2O 0.2g，NaCI 0.lg，Na2MO04 H20 0.002g，FeCl30.01 g，pH 7.0；
其中，所述印度拜葉林克氏菌發酵培養基：葡萄糖5g/L，甘蔗糖蜜40 g/L，氯化銨1 g/L，豆粕粉20 g/L，磷酸氫二鉀0.2 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，鉬酸鈉0.01 g/L，氯化鐵0.01 g，碳酸鈣5g ，pH7.0；各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
步驟四、將步驟一至步驟三中制備的彎曲芽孢桿菌發酵液10-30份，巴氏梭菌發酵液30-80份，印度拜葉林克氏菌發酵液20-60份，混合均勻，用檸檬酸調PH至3.2，即為復合固氮微生物菌肥。
長期以來，根瘤菌和自生固氮菌等雖具有較強的固氮能力，但抗逆性低，不耐貯存，不利于我國生物固氮菌肥的商品化和推廣使用。自1958年Hin首次在日本分離得到一株具有高固氮活性的芽抱桿菌后，土壤中新發現的具有固氮作用的芽抱桿菌越來越多。具有固氮作用的芽孢桿菌添加到生物肥料中，可使生物肥料耐酸、耐鹽、耐高溫和耐高壓，為生物固氮肥料的研發、推廣和應用將起著重要作用。本發明復合固氮微生物菌肥中的彎曲芽孢桿菌具有較強的固氮作用，并且具有明顯的根跡促生作用。
本發明復合固氮微生物菌肥中含有的彎曲芽孢桿菌，可在作物表面、植株內部或土壤中繁殖生長的同時必定向植物根際分泌某些次生代謝產物，能夠提高植物對養分的吸收、刺激植株生長和抑制病菌等綜合功能。彎曲芽孢桿菌還能夠防治植物病害源于其能夠產生多種抗菌物質，包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類和核酸類等多種化合物，這些抗菌物質能抑制真菌、細菌、病毒和菌原體等的正常生長。
本發明復合固氮微生物菌肥中含有巴氏梭菌，其屬厭氧性非共生固氮細菌，也叫丁酸發酵芽孢桿菌。在自然界和土壤中分布很廣，數量較多，每克土壤約含巴氏梭菌10-100余萬，是土壤中其它固氮菌數量的100-1000倍，所以巴氏梭菌在土壤生物固氮中所起的作用是不可忽視的，向土壤中額外補充已經馴化好的具有高效固氮能力的巴氏梭菌使得固氮效果更加顯著是具有重要意義的。
本發明復合固氮微生物菌肥中含有印度拜葉林克氏菌，印度拜葉林克氏菌高度耐酸，生長在PH3-9.5或10之間。在中性和堿性條件下產酸，在很酸的條件下，能產生一種堿性物質，從而提高土壤的PH，好氧菌，具有較強的固氮能力，但在降低氧壓的情況下也能生長和固氮，在液體發酵過程中會產生粘稠的半透明的多糖物質，由于有多糖物質的存在，對其保存過程中有明顯的保護作用，可以使其延長保質期。
本發明的有益效果與優點：
、本發明中的印度拜葉林克氏菌具有廣泛的PH適應性，能在在PH3-9.5或10之間生長，而彎曲芽孢桿菌與巴氏梭菌都能形成芽孢，將復合固氮微生物菌肥的PH調低至3.2，保證了雜菌無法在本發明的固氮微生物菌肥中生長，防止了彎曲芽孢桿菌與巴氏梭菌的芽孢萌發，減少了兩種芽孢桿菌在保存過程中的損失，同時，由于多糖物質的存在，也保護了印度拜葉林克氏菌，延長了其保質期。經過檢測，常溫保存一年，兩株芽孢的損失率低于20%，印度拜葉林克氏菌的損失率低于35%。
、本發明創造性的將“好氧”、“厭氧”兩大固氮菌群融為一體，一類為好氧性的固氮菌--印度拜葉林克氏菌（其低氧下也能固氮，但主要是好氧菌）與彎曲芽孢桿菌；另一類厭氧固氮菌—巴氏梭菌，都具有較強的固氮能力，能在土壤較深層的土壤中進行固氮（10-30cm），能把空氣中的氮轉化成植物能吸收的氮，源源不斷的提供給植物。微生物菌通過生產、捕食、被捕食和分解的角色分工協作，充分利用自然資源并通過微生物生長、繁殖、死亡等一系列的微生物代謝活動及微生物死亡殘體被活菌循環再用，為土壤創造腐殖質，為作物提供各種所需的微量元素，增加土壤內的有機質含量，提升土壤肥力。在這一系列微生物活動中會產生大量的“磷酸聚糖”，幫助分解土壤中因長期過量使用化肥導致固化、鈣化的化學物質，促進土壤疏松，使多年沉淀在土壤中的各種礦物元素充分為植物根系吸收利用，恢復土壤肥力，提高產出能力，凈化土地、河流、空氣。
本發明復合固氮微生物菌肥PH適用范圍廣，好氧與厭氧條件下都具有較強固氮能力的，且易于保存，保存時間長等特點。
具體實施方式
實施例1
一種復合固氮微生物菌肥，其特征在于，所述的復合固氮微生物菌肥的原料配比為：彎曲芽孢桿菌發酵液20份，巴氏梭菌發酵液50份，印度拜葉林克氏菌發酵液30份。
根據權利要求1所述的一種復合固氮微生物菌肥，其特征在于，其制備方法，包括以下步驟：
步驟一，彎曲芽孢桿菌發酵液的制備
取出彎曲芽孢桿菌保藏管，用無氮固體培養基分別劃平板進行復蘇，30℃培養96小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有無氮固體培養基，在30℃培養箱中培養72小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L彎曲芽孢桿菌發酵培養基的500L發酵罐中，開攪拌200r/min，前8小時通氣量為100L/min，8-24小時后通氣量為200L/min ，24小時后通氣量為360L/min ，30℃培養53小時，檢測其芽孢含量為58億CFU/ml，即作為彎曲芽孢桿菌發酵液；
其中，所述無氮固體培養基：蔗糖10g，磷酸氫二鉀0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，硫酸鈣0.1g，碳酸鈣5g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH7.2；
其中，所述彎曲芽孢桿菌發酵培養基：糖蜜40g/L，玉米淀粉10 g/L， 豆粕粉20 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，硫酸錳0.3g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，碳酸鈣10 g/L， pH7.0；各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
步驟二，巴氏梭菌發酵液的制備
取-80℃甘油管保藏的菌種1mL接種于裝有9mLRCM培養基的試管中，37℃條件下靜態厭氧活化48h。將活化好的菌種按1%(v/v)的接種量轉接到滅過菌的100L巴氏梭菌種子培養基中。37℃條件下靜態厭氧培養24h~36h，菌含量超過5億CFU/ml，即可作為巴氏梭菌種子繼續接種。將100L巴氏梭菌菌種子接至裝有900L已經滅菌的巴氏梭菌發酵培養基的1噸的發酵罐中，抽真空，37℃培養9天，巴氏梭菌產生芽孢，檢測芽孢含量為75億CFU/ ml，即可停止培養，即為巴氏梭菌發酵液；
其中，所述的RCM培養基：胰蛋白陳10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5克/L，醋酸鈉3g/L，pH7.0，121℃滅菌20min；
其中，所述的巴氏梭菌種子培養基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸鎂1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃滅菌20min；
巴氏梭菌發酵培養基：大米粉40g/L，酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸鎂1g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖5g/L， PH7.0，121℃滅菌20min。
步驟三，印度拜葉林克氏菌發酵液的制備
取出印度拜葉林克氏菌菌種保藏管，用印度拜葉林克氏菌固體培養基分別劃平板進行復蘇，30℃培養120小時。在平板下挑取單個菌落接種50毫升印度拜葉林克氏菌液體培養基中，在培養箱中30℃震蕩培養96小時。種子采用10%的接種量，接種至5L大三角瓶中，裝液量為2L，二級無氮液體種子培養基，30℃震蕩培養96-120小時，檢測其菌液濃度，活菌含量超過5億cfu/ml，即可作為印度拜葉林克氏菌液體菌種接種至裝有600L印度拜葉林克氏菌發酵培養基的1000L發酵罐中，接種量為10%，開攪拌120r/min，前24小時通氣量為200L/min，24小時后通氣量為480L/min ，30℃培養60小時，檢測其菌體含量為72億cfu/ml，即可結束發酵，即得到印度拜葉林克氏菌發酵液；
其中，所述印度拜葉林克氏菌固體培養基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，水洗瓊脂20 g，蒸餾水1.0L，pH 7.2；
其中，所述印度拜葉林克氏菌液體培養基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，蒸餾水1.0L，pH 7.2；
其中，所述二級無氮液體種子培養基：蔗糖20g，蘋果酸5.0g, K2HPO4.H2O 0.lg,KH2PO4 .H20 0.4g，MgS04.7H2O 0.2g，NaCI 0.lg，Na2MO04 H20 0.002g，FeCl30.01 g，pH 7.0；
其中，所述印度拜葉林克氏菌發酵培養基：葡萄糖5g/L，甘蔗糖蜜40 g/L，氯化銨1 g/L，豆粕粉20 g/L，磷酸氫二鉀0.2 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，鉬酸鈉0.01 g/L，氯化鐵0.01 g，碳酸鈣5g ，pH7.0；各培養基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
步驟四、將步驟一至步驟三中制備的彎曲芽孢桿菌發酵液20份，巴氏梭菌發酵液50份，印度拜葉林克氏菌發酵液30份，混合均勻，用檸檬酸調PH至3.2，即為復合固氮微生物菌肥。
實施例2
實施例1制備的復合固氮微生物菌肥在辣椒上的應用效果（簡稱菌肥）
1試驗時間：2015年5月-8月
2．試驗地點：湖南省隆回縣灘頭鎮中橋村
3．試驗方法：
試驗組：移植時將幼苗用200倍菌肥稀釋液沾根30分種，在定植后10天后，用菌肥1000倍稀釋液灌根1次總用菌2公斤/畝，總施氮肥為20公斤/畝；對照組用清水沾根與灌根，總施氮肥為40公斤/畝；
4．試驗結果：
、對產量的影響與經濟效益結果發現，使用復合固氮微生物菌肥的平均單產726 kg /畝，對照組平均662kg/畝，平均每畝增產64kg，增產率為9.67%，畝增產值153.6元（按市場價：鮮椒2.4/公斤）。試驗組在少施50%的氮肥的情況下還有明顯的增產，是我們沒有預計到的；
、對果實的保鮮效果：
辣椒成熟后，將試驗組、對照組取出20個成熟度一致的果實置于清水中浸泡，放置于相同的環境中，對照組4天后開始發黑，浸泡6天后果實果肉軟化，而試驗組浸泡5天后才開始發黑，浸泡8天后果肉軟化，表明復合固氮微生物菌肥對果實有保鮮作用，便于長途運輸；
、試驗過程中，試驗組的土壤松軟、濕潤，稍用力即散；對照組硬朗刺手，用力不散，呈明顯的板結狀。
實施例3
復合固氮微生物菌肥在黃瓜上的應用效果
1．試驗地點：山東省壽光市某種植戶
2．試驗方法：試驗組：移植時將幼苗用200倍菌肥稀釋液沾根20分種，在定植后10天后，用菌肥1000倍稀釋液灌根1次，總施菌肥量為2公斤，氮肥為15公斤；對照組：用清水沾根與灌根，總施氮肥為30公斤/畝；
3．試驗結果：移植后，發現沾根的植株葉片比較新鮮，而且生長勢好，沒有打蔫的了，使用復合固氮微生物菌肥的植株比對照組提前一個星期期現花。在大部分的都開過花后觀察發現，發現試驗組的花開的比沒噴鮮艷的多，而且花的質量很好，色艷，花大，花看上去就比較“壯”，而且從整個植株的生長來看，生長勢明顯好于沒噴過的，期間用過的黃瓜表現為葉色翠綠、植株整齊且土壤表現為疏松，從口感上黃瓜要清脆、香甜。而末用過的則葉色黃綠、植株參差不齊。 實際測產時，試驗組比對照組的增產12.9%，由于常年施用化肥過多，土壤酸化嚴重，其土壤PH才4.5，這也可能是減少一半的氮肥還有明顯增產的一個原因吧。
實施例4
復合固氮微生物菌肥在草莓上試驗效果
1．試驗地點：湖南省隆回縣周旺鎮某種植戶；
2．試驗方法：在定植期，將苗栽好，用復合固氮微生物菌肥500倍稀釋液灌根1次，開發結果期，用復合固氮微生物菌肥500倍稀釋液灌根1次，總用量為菌肥2公斤；進口氮肥10公斤；對照組：用清水沾根與灌根，進口氮肥為20公斤/畝；
3．試驗結果：
結果發現，提前開花結果，果實大而飽滿，結果數多，異形果少，口感好，著色鮮亮，草莓（豐香）的單株產量平均為126.9g，較對照（不施菌肥）提高8.95％，而且施用菌肥后草莓果實的可溶性固形物含量達10.14％，較對照相對高12.4％，同時，施用菌肥后，酸含量降低，Vc含量提高，果實的風味和品質得到明顯改善，并且耐儲存，比不使用菌肥的草莓多儲存10天以上。使用復合固氮微生物菌肥的地塊比對照區提高產量29%，糖度比對照區提高1-2度。
根據上述說明書的揭示和教導，本發明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發明的一些修改和變更也應當落入本發明的權利要求的保護范圍內。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，并不對本發明構成任何限制。