一種利用藍莓葉提取液生物合成的納米銀抑菌劑及其制備工藝的制作方法

本發明涉及一種利用藍莓葉提取液生物合成的納米銀抑菌劑及其的制備工藝，屬于抗菌劑技術領域。

背景技術：

人們使用銀類殺菌劑進行殺菌消毒有著悠久的歷史，銀元素或銀離子能夠結合在微生物細胞膜的表面，改變其通透性，進而與菌體內的蛋白和核酸結合，影響細菌分裂增殖，最終導致其死亡。近年來, 隨著納米技術的迅猛發展, 納米材料因其獨特的量子效應、小尺寸效應以及大的比表面積而顯現異于常規材料的優異特性，引起人們廣泛的研究興趣。納米銀 (Silver nanoparticles, AgNPs) 是采用納米技術制備的納米狀態下的單質銀，其殺菌作用比普通無機銀殺菌劑進一步提升，其抗菌譜廣、抗菌活性強，并且不易產生耐藥性，為新一代抗菌劑的研發開辟了新的方向，具有廣闊的開發前景。

傳統制備納米銀主要通過物理、化學等方法，但物理方法對設備要求高，而化學方法采用的化學試劑又對環境和人體健康造成危害。另外，上述方法制備的銀納米粒子極易氧化、團聚，限制其在實際應用中的推廣。近年來，人們開始嘗試利用植物、微生物等生物體內蘊含的活性物質作為還原劑和穩定劑制備納米銀，與傳統的納米銀制備方法相比，納米銀生物合成法不需添加任何還原劑、價格低廉，反應條件溫和、綠色環保，合成效率高、利于工業化放大。另外，生物提取物中富含蛋白質、脂類、多糖等生物大分子，能夠與納米材料結合而賦予其獨特的理化性狀和生物學特性，使產物更加穩定、抑菌效果更顯著。因此，納米生物合成法成為納米合成領域的新熱點，具有廣闊的研究和發展前景。

藍莓 (Vaccinium Spp.), 為多年生小漿果灌木，屬杜鵑花科，越橘屬。起源于北美，現已在世界范圍內廣泛種植，目前有450多個品種。藍莓的果實中含有豐富的營養成分，主要有花青素、兒茶酸、黃酮醇、黃烷醇、綠原酸、丹寧酸、超氧化物歧化酶、抗壞血酸、氨基酸以及微量元素等成分。藍莓具有抗氧化、防止腦神經老化、保護視力、預防心血管疾病、抗衰老、增強機體免疫力、抗癌等功效。因此，藍莓被聯合國糧農組織列為人類五大健康食品之一。藍莓葉是藍莓種植的副產品，在果實采摘后被大量遺棄在枝頭上。然而，近年來不少研究表明藍莓葉中的綠原酸、多酚類物質等抗氧化成分與果實中的含量持平、甚至更高。因此，藍莓葉可以作為藍莓果實中成分的替代品加以利用。

技術實現要素：

本發明的目的在于解決上述現有技術存在的不足之處，提供一種采用藍莓采摘廢棄物為原料，利用藍莓葉中的豐富抗氧化物質為還原劑，生產成本低廉，反應溫和環保，能夠避免傳統化學合成法危害環境的弊端，而且合成時間短，生產效率的利用藍莓葉提取液生物合成的納米銀抑菌劑及其制備工藝。

本發明的一種利用藍莓葉提取液生物合成的納米銀抑菌劑的制備工藝，其特殊之處在于包括以下步驟：

1、備料

采集藍莓葉片，洗凈后烘干至恒重，得到干燥的藍莓葉片；

所述藍莓葉片先用水沖洗干凈，再用雙蒸水洗滌2-5次；

所述藍莓葉片置于烘箱中烘干，烘箱內的溫度控制在50-70℃；

2、制備藍莓提取物

將干燥的藍莓葉片剪碎，連同提取劑一起置于回流裝置內進行加熱回流，干燥的藍莓葉片與提取劑按照質量比1:（2-100）的比例混合，將加熱回流后的產物自然冷卻、過濾， 然后進行離心處理，取上清液即得到藍莓葉片提取液，保存備用；

所述提取劑為雙蒸水、乙醇、乙醚中的任意一種；

所述加熱回流的溫度控制在40-100℃，加熱回流0.5-12小時；

所述離心處理在離心機內進行，離心機的轉速控制在 5000-10000轉/分，離心10-15分鐘；

所述保存備用是在0-10℃的環境下進行避光保存；

3、以藍莓葉片提取物為還原劑一步法生物合成納米銀

將AgNO₃溶液與雙蒸水按照體積比為1﹕（1-1000）的比例混合制得混合液，再加入藍莓葉片提取液攪拌均勻后進行加熱回流處理，其中，藍莓葉片提取液與混合液的體積比為1﹕（1-100），待溶液變為金黃色后停止加熱回流，即得到生物合成的納米銀抑菌劑，避光保存；

所述AgNO₃溶液的濃度為0.01-1mol/L；

所述加熱回流的溫度控制在40-100℃，加熱回流0.5-12小時；

所述避光保存的溫度控制在0-10℃。

本發明利用藍莓葉提取液生物合成的納米銀抑菌劑，采用的原料藍莓葉為藍莓果實采摘后廢棄物，通過本發明可以將其充分利用，本發明涉及的合成方法生產成本低廉，反應溫和環保，能夠避免傳統化學合成法危害環境的弊端，合成時間短，生產效率高，抑菌實驗表明，藍莓葉生物合成納米銀抑菌劑對鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、點狀氣單胞等4種水產病原菌的抑菌圈大小分別為12.7、14.4、13.9和11.9mm，其中以20 μg/mL的本品處理鰻弧菌4 小時后抑菌率可達99.2 %。說明該抑菌劑對水產病原菌抑菌譜廣，抑菌效果顯著，在水產養殖領域中有著廣闊的應用前景。

圖1：利用藍莓葉片提取液生物合成的納米銀抑菌劑的紫外可見吸收圖譜；

圖2：利用藍莓葉片提取液生物合成的納米銀抑菌劑的透射電鏡照片；

圖3：利用藍莓葉片提取液生物合成的納米銀抑菌劑對鰻弧菌的抑菌圈實驗；

圖4：利用藍莓葉片提取液生物合成的納米銀抑菌劑對溶藻弧菌的抑菌圈實驗；

圖5：利用藍莓葉片提取液生物合成的納米銀抑菌劑對副溶血性弧菌的抑菌圈實驗；

圖6：利用藍莓葉片提取液生物合成的納米銀抑菌劑對點狀氣單胞菌的抑菌圈實驗；

圖7：不同濃度的藍莓葉片提取液生物合成的納米銀抑菌劑對鰻弧菌的抑菌動力學曲線。

具體實施方式

下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

本實施例的一種利用藍莓葉提取液生物合成的納米銀抑菌劑的制備工藝，包括以下制備工藝：

（1）材料準備：

采集北高叢藍莓 (Vaccinium corymbosum L.) 葉片，先用自來水沖洗干凈，再用雙蒸水洗滌3次，置于烘箱中， 60℃烘干，得到干燥的藍莓葉片。

（2）藍莓提取物的制備：

用分析天平稱取5.0g藍莓葉片，將葉片剪碎，加入10 mL提取劑，在40℃下在索氏提取器中加熱回流12小時，將制得的溶液自然冷卻，用濾紙過濾， 然后 5000 rpm 離心15分鐘，取上清即得到藍莓葉片提取液，4℃保存備用。

（3）以藍莓葉片提取物為還原劑一步法生物合成納米銀：

取10 mL雙蒸水于100 mL圓底燒瓶中，加入10 mL 0.01 mol/L的AgNO₃溶液，再加入20 mL上述藍莓葉片提取液，攪拌均勻，20℃加熱回流約12小時，待溶液逐漸變為金黃色時停止加熱，即得到生物合成的納米銀抑菌劑，4℃避光保存。

實施例2

本實施例的一種利用藍莓葉提取液生物合成的納米銀抑菌劑的制備工藝，包括以下制備工藝：

（1）材料準備：

采集矮叢藍莓 (Vaccinium angustifolium L.) 葉片，先用自來水沖洗干凈，再用雙蒸水洗滌5次，置于烘箱中，70℃烘干，得到干燥的藍莓葉片；

（2）藍莓提取物的制備：

用分析天平稱取5.0g藍莓葉片，將葉片剪碎，加入500 mL提取劑，在100℃下在索氏提取器中加熱回流0.5小時，將制得的溶液自然冷卻， 10000 rpm 離心10分鐘，取上清即得到藍莓葉片提取液，10℃保存備用；

（3）以藍莓葉片提取物為還原劑一步法生物合成納米銀：

取60 mL雙蒸水于100 mL圓底燒瓶中，加入60μL 1 mol/L的AgNO₃溶液，再加入0.5 mL上述藍莓葉片提取液，攪拌均勻，80℃加熱回流約10小時，待溶液逐漸變為金黃色時停止加熱，即得到生物合成的納米銀材料，4℃避光保存。

實施例3

（1）材料準備：

采集北高叢藍莓 (Vaccinium corymbosum L.) 葉片，先用自來水沖洗干凈，再用雙蒸水洗滌3次，置于烘箱中，60℃烘干，得到干燥的藍莓葉片。

（2）藍莓提取物的制備：

用分析天平稱取5.0g藍莓葉片，將葉片剪碎，加入100 mL提取劑，在90℃下在索氏提取器中加熱回流1小時，將制得的溶液自然冷卻，用Whatman No.1定性濾紙過濾， 然后 5000 rpm 離心10分鐘，取上清即得到藍莓葉片提取液，4℃保存備用。

（3）以藍莓葉片提取物為還原劑一步法生物合成納米銀：

取20 mL雙蒸水于100 mL圓底燒瓶中，加入200μL 0.1 mol/L的AgNO₃溶液，再加入2 mL上述藍莓葉片提取液，攪拌均勻，90℃加熱回流約1小時，待溶液逐漸變為金黃色時停止加熱，即得到生物合成的納米銀抑菌劑，4℃避光保存。

實施例4

在實施例的步驟（3）之后再進行下述步驟

（4）紫外-可見分光光度計檢測：

采用紫外-可見分光光度計檢測步驟3得到的生物合成的納米銀溶液的最大吸收波長，掃描波長范圍為200-800 nm。從附圖1可以看出納米銀溶液在425 nm 附近出現了一個明顯的吸收峰，而典型的銀納米粒子在400-500 nm范圍內由于特征性的表面等離子體共振而產生特征吸收峰，由此可以說明藍莓葉片提取物成功將AgNO₃還原成納米銀顆粒。

（5）透射電鏡檢測：

取5-10 μL步驟3得到的生物合成的納米銀滴加在銅網上，室溫干燥，用透射電子顯微鏡在80-300 kV電壓下觀察納米銀顆粒的形態及粒徑，從附圖2可以看出生物合成的納米銀顆粒為球形，納米顆粒粒徑大小為 10-30 nm，粒徑相對均勻。

將制備的納米銀抑菌劑用如下兩種抑菌實驗檢測其抑菌活性：

（6）抑菌圈實驗：

分別選用4種水產病原菌（鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、點狀氣單胞）作為指示菌，采用常規杯碟法檢測生物合成納米銀抑菌劑的抑菌活性。

供試海洋水產病原菌采用2216E培養基 (蛋白胨5g，酵母膏1 g，磷酸高鐵0.01g，陳海水定容至1000 mL)，28℃培養。取供試菌50 μL加到5 mL液體培養基中，150 rpm震蕩8-10 h，至對數增長期，細菌培養液用生理鹽水稀釋菌液濃度至10⁶ CFU/mL，取100μL均勻涂布于2216E固體培養基上，然后在培養基上放置牛津杯（杯外徑8mm），加入生物合成納米銀抑菌劑20 μL，另以生理鹽水和藍莓葉片提取液各20 μL做為對照，將培養平皿置于28℃恒溫培養箱中培養過夜，觀察牛津杯周圍抑菌圈的產生。實驗結果表明藍莓葉片提取液本身具有一定的抑菌活性，僅對牛津杯內的水產病原菌有部分的抑菌效果（附圖3-6中的c）；以藍莓葉片提取液合成的納米銀則對所有供試水產病原菌均產生顯著的抑菌圈，對鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌和點狀氣單胞等4種水產病原菌的抑菌圈大小分別為12.7、14.4、13.9和11.9 mm（附圖3-6中的a）；而生理鹽水則對供試水產病原菌完全沒有抑制作用（附圖3-6中的b）。上述結果表明藍莓葉片中的活性物質能有效合成的納米銀，并對生成的納米銀具有協同抑菌效應，賦予其較高的抑菌活性。

（7）抑菌動力學實驗：

以鰻弧菌為指示菌，將鰻弧菌在2216E液體培養基中28℃，150 r/min培養至對數增長期，將培養好的菌液稀釋到1×10⁶ CFU/mL。將稀釋菌液分裝到三支試管中，其中兩支試管分別加入不同量的生物合成納米銀抑菌劑（終濃度分別為10、20 μg/mL），另一支試管加入生理鹽水做為對照，置于28℃恒溫搖床中150 r/min培養，每隔0、10、30、60、120、180、240 min取樣，用分光光度計測細菌培養液在600 nm下的吸光度值（OD₆₀₀），繪制細菌生長動力學曲線，檢測我們的產品對鰻弧菌生長的影響。由附圖7可以看出10 μg/mL的納米銀處理組能夠延遲鰻弧菌到達對數增長期的時間；20 μg/mL的納米銀對鰻弧菌都能產生強烈的抑制作用，隨著培養時間的延長，該組菌液的OD值幾乎沒有發生變化，說明其中的細菌幾乎沒有任何增殖現象；而生理鹽水對照組中的細菌能夠迅速到達對數增長期，菌體數目得到快速增長。經計算可知10 μg/mL和20 μg/mL的本產品4 小時后對鰻弧菌的抑菌率分別為55.6%和99.2%。上述實驗表明藍莓葉提取物生物合成的納米銀在水環境中能夠顯著抑制水產病原菌的生長，對新型納米銀抑菌材料在水產養殖中的應用奠定了基礎。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。