用于生產三維多細胞物體的方法和裝置與流程

說明

本發明涉及根據權利要求1的前序部分的用于生產三維多細胞物體的方法、根據權利要求13的前序部分的用于生產三維多細胞物體的裝置、以及根據權利要求15的前序部分的這種裝置的用途。

三維多細胞物體也可以稱為生物材料的細胞物體。通過所謂的生物印刷方法生產這樣的物體是已知的。在此，術語“印刷”是指生物材料的三維結構化。通常，通過凝膠以預先選擇的結構形成生物細胞。用于這種生物印刷方法的過程是所謂的噴墨印刷、所謂的注射器印刷或生物印刷、以及所謂的激光印刷。這三個過程中的每一個具有特定的優點，但也有局限性。

在噴墨印刷方法中，通過壓電噴嘴將液體中的細胞推進到載體上。該過程與商業紙-噴墨印刷過程類似地工作，唯一的例外是使用具有懸浮在其中的細胞的載體液體形式的生物油墨代替用于印刷的油墨。通過這個過程，可以印刷出非常精細的量，但是該方法的精確度有些地方不能令人滿意，因為由壓電噴嘴產生的液滴被來自壓電噴嘴的載體液體中的生物細胞推進并且必須在壓電噴嘴的端部與旨在接收待印刷物體的表面之間的距離上穿過空氣飛行。液滴在飛行中經受變形，從而導致它們在飛行過程中經受擺動運動。這導致這種噴墨打印機的不精確性，因為細胞并不總是達到其預期位置。此外，因為分層僅能夠從上方進行，因此待生產的物體的三維分層結構受到限制，使其難以產生支撐結構和懸伸結構。

這樣的噴墨印刷方法描述于例如wo99/48541a1、us2009/0208466a1、us2011/0076734a1和us2011/0250688a1中。

注射器印刷方法目前是生物印刷領域中最常用的印刷方法。在該方法中，將待印刷的材料裝入注射器中并通過壓縮空氣或沖壓壓力從注射器中擠出去。在這種情況下，注射器的噴嘴根據待印刷的物體由x-y-z移動單元移動進入其預期位置。然后將指定量的印刷材料在旨在用于印刷的位置處壓出注射器。以這種方式，生產由層構成的三維物體。該方法的優點是簡單的結構，但精確計量是只能通過復雜過程可能的。此外，如果使用不同的細胞來構成三維物體的結構，除了第一注射器之外或代替第一注射器，另外的注射器必須保持保留并用于印刷。這增加了相應打印機的結構復雜性和實際印刷所需的時間二者。最終，這反映在高成本上。

這種種類的注射器印刷方法例如在wo2013/113883a1、us2011/0313542a1、us8,580,546b2、和us2012/0288938a1中描述。us2014/0093932a1還描述了一種注射器印刷方法，其中已經在預期部位積聚的生物材料的附加固化通過uv光進行。

在激光印刷方法中，通過激光束進行印刷。在此，載體膜最初涂覆有含有細胞的液體。此后，激光束脈沖被引導到涂覆的載體膜上，導致一滴細胞懸浮液從載體膜推出。單獨的液滴然后可以通過技術的堆疊而在彼此上方堆疊-類似于噴墨印刷方法。確實，待施用的細胞懸浮液的液滴的量可以以相當高的精度劑量。然而，液滴在飛向表面途中的飛行階段期間變形，在該表面上待產生待印刷的物體。由于與其相連的擺動運動，這進而導致液滴定位的不準確性。由于液滴尺寸整體來說相當小，所以激光印刷方法非常慢。較大且更復雜的物體不能通過這種方法印刷。此外，不能生產沒有支撐結構的懸掛結構。

本發明的目的是提供一種由生物材料構成的三維物體的印刷方法，該方法克服現有技術中已知的缺陷并且特別地使得可以進行高精度的物體結構化和在印刷物體中以簡單的方式使用不同的材料。此外，將提供可以實現該方法的一種相應設備。

該目的通過一種用于生產具有如權利要求1所述的特征的三維多細胞物體的方法來實現。在這種方法中，首先將第一可光聚合液體引入反應容器中。此后，將第一光束聚焦在位于填充有該第一液體的反應容器的區域內的第一焦平面上。通過該光束，然后在反應容器中生產第一聚合結構。在這種情況下，該第一聚合結構位于第一層中。

在進一步的工藝步驟中，將另外的可光聚合液體引入反應容器中，其中先前生產的聚合結構至少部分地被該另外的可光聚合液體覆蓋。優選地，先前生產的聚合結構完全被該另外的可光聚合液體覆蓋。另外的光束現在聚焦在另外的焦平面上，該焦平面位于反應容器的填充有另外的液體的區域中。因此，另外的焦平面與第一焦平面至少相對于已經生產的聚合結構或相對于該聚合結構的層不同。

借助于另外的光束，現在在反應容器中在另外的層中生產另外的聚合結構。在這種情況下，另外的聚合結構直接安排在先前生產的聚合結構上并與其連接。結合優選由共價結合組成。然而，原則上，非共價結合，例如基于物理相互作用，也將是可以想到的。

引入另外的可光聚合液體、聚焦另外的光束、并在另外的層中生產另外的聚合結構的上述步驟現在各自用一種另外的可光聚合液體重復，直到生產所希望的三維多細胞物體。通過其中發生可光聚合液體的聚合的不同焦平面，因此實現三維多細胞物體的分層結構。在此，底切和懸伸結構也是可能的，因為即使當其下沒有安排已經聚合的材料、而是只有尚未聚合的材料時，可以發生特定焦平面或層中的可光聚合液體的聚合。存在于焦平面以外的該可光聚合液體的聚合不發生；相反，只有位于焦平面內的可光聚合液體才被聚合。盡管如此，存在于焦平面以外的液體用作對焦平面中存在的液體的臨時支撐，不需要用于此目的的固體支撐結構。

該第一可光聚合液體和/或該另外的可光聚合液體中的至少一種含有生物細胞。當作為光照射的結果發生聚合時，包含在液體中的細胞也嵌入相應的聚合物中。由于不是所有的可光聚合液體還需要含有細胞，所以可以在所生產的三維多細胞物體中形成無細胞結構，例如以中間結構的形式。

使用這種方法，復雜的生物物體可以作為模型生產，例如用于表示和研究細胞-細胞相互作用、器官生物起源、疾病或器官功能。這種三維物體具有超過典型的二維細胞培養物的明顯優點，特別是在對多種細胞類型之間的相互作用建模的情況下。原因是細胞-細胞相互作用的復雜性、天然屏障的功能以及疾病或器官的建模不能使用經典的二維細胞培養物充分說明。

此外，在此描述的方法使得可以以特別簡單的方式生產小型化模型。在過去，這種小型化模型是手工部分地生產的。這種生產所要求的復雜性非常高；此外，還要求多年的經驗。

最后，通過在此描述的方法，可以確保相同三維多細胞物體的不同復制品的高再現性。其結果是，與現有技術中已知的其他方法相比，在此描述的方法不僅使得可以加速生產，而且所生產的物體也總是顯示相同的品質。這種高再現性在生物技術中是特別有利的。原因是在分析和開發新的藥物產品時，對三維細胞培養物進行的測試總是保持不變，大大降低了開發成本。相比之下，當這種復雜的三維結構用手工構建時，單獨的波動是不可避免的。然而，這使得實際上不可能實現可再現的測試結果。相比之下，在此描述的方法提供出色好地適合于實現可再現的測試結果的物體。

作為反應容器，可以使用常見商業微量滴定板(例如具有6、12、24、48、96、384或1536個孔的微量滴定板)、細胞培養瓶或陪替氏培養皿的腔(所謂的孔)。

通過該方法生產的三維多細胞物體可以由均質材料構成并且因此僅包含單一類型的細胞。此外，圍繞細胞的聚合物材料可以被配置為是均勻的。然而，在一個變型中，該第一可光聚合液體和該另外的可光聚合液體中的至少一種是不同的液體。這使得可以生產包括不同類型的細胞的非均質構造的多細胞物體。此外，以這種方式，可以在不同的周圍聚合物中提供相同或不同的細胞。這意味著不同的液體可以相對于液體中的可聚合材料和相對于液體中所含的細胞二者都不同。因此，該變型提供了一種方法，通過該方法將不同的細胞類型組合以形成人造器官。該器官可以是模擬或模仿人體或動物器官的器官。這使得在單次印刷操作中可以在相同的反應容器內或在相鄰的反應容器內生產不同的物體。

當通過本發明方法生產人造器官時，該器官模型可以是代表健康器官的模型。可替代地，也可以以具有特定缺陷的器官的形式生產疾病模型。例如，機械收縮可以被引入到通過本發明方法生產的物體中以便產生“內置”損傷，例如在使用鈍器或鈍挫傷的擊打的情況下會發生的。以這種方式，可以提供這種疾病模型的標準化結構。也可以在物體內產生退化梯度。例如，可以在物體的第一區域中產生相對健康的細胞結構，其然后通過所產生的物體中的局部梯度連續地轉變成患病結構。在這種情況下，中間的、部分患病的結構將位于兩個極端結構之間產生的物體中。此外，也可能通過結合病毒或細菌來生產人造器官的感染模型。這種細菌或病毒的結合可以在印刷過程中通過選擇合適的另外的含有相應的病毒或細菌作為細胞的可光聚合液體以上述方式進行。

通過選擇合適的細胞類型，還可以產生典型疾病如糖尿病、腫瘤或受損組織的疾病模型，例如在生物有機體中的心肌梗死或中風之后將發現的。由于除了含有細胞的可光聚合液體以外還可以使用無細胞的可光聚合液體，所以在無細胞聚合物中生產的物體的“包裝”可以在其中也生產物體本身的相同印刷操作中產生。這意味著物體與其載體一起并且在其載體中同時產生，使得并行生產包裝和多細胞物體。

在一個變型中，可光聚合液體包含通過其實現聚合的丙烯酸化合物。總體上，該丙烯酸化合物優選選自下組，該組由以下各項構成：甲基丙烯酸酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸丁酯、三羥甲基丙烷丙烯酸酯、丙烯酸三丙烯酸酯(triacrylateacrylate)和聚丙烯酸酯(pa)。

在一個變型中，該丙烯酸化合物連接到待膠凝或聚合的起始物質上。特別地，該連接產生該丙烯酸化合物與該待聚合的起始物質之間的共價結合。該起始物質的實例可以包括碳基聚合物，諸如聚乙二醇(peg)、聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚酮(pk)、聚氯乙烯(pvc)、聚苯乙烯(ps)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)和聚氨酯(pu)。合成聚合物如硅酮、聚二甲基硅氧烷(pdms)或樹脂如三聚氰胺樹脂或三聚氰胺甲醛樹脂也適合作為起始物質。此外，生物聚合物如蛋白質、dna、rna、碳水化合物和碳水化合物衍生物、膠原、纖維蛋白、藻酸鹽或明膠也適合作為起始物質。代替上述聚合物，這些聚合物的相應單體前體或低聚物前體也可以用作起始物質，只要它們可以以固體或液體聚集狀態以穩定的形式提供。將丙烯酸酯官能團通過丙烯酸化合物與起始物質之間的連接引入起始物質中提供了可聚合基質，即使起始物質已經是聚合物。

當使用可光聚合pdms作為基質或涂覆物質時，在嵌入該基質的細胞之間氣體交換是可能的。如上所提及的，可以使用不同的涂覆物質或基質。例如，除了顯示出良好的生物相容性的pdms或另一種基質之外，穩定的塑料可用于剩余的基質，以便產生對外部穩定的物體并且在其內部含有允許細胞生長的較不穩定的基質。如上所提及的，因此據說可以并行于三維多細胞物體，可以產生其固有保護或其自己的包裝。

具有添加的丙烯酸酯官能團的起始物質以液體形式使用，具有不同的粘度是可能的。這意味著在此描述的方法不限于具有特定粘度的液體，而且也可以使用低粘度液體作為起始物質。在這種情況下，這些液體的流動行為可以范圍為從觸變性到流變性。

液體可以是溶液或膠體分散混合物如懸浮液。在這種情況下，液體可以具有水性至油性特性。除了其他因素之外，這通過選擇起始物質及其粒徑決定。

因此，可以實現帶有丙烯酸酯官能團的起始物質的光聚合，此外使用在本方法的上下文中使用的光的選定波長處形成自由基的自由基形成劑(所謂的光引發劑)。

適合的自由基形成劑的實例包括蒽酮衍生物如紫藤酮或異紫蒽酮、熒光素、紅熒烯、蒽衍生物、并四苯衍生物、苯并蒽酮、苯并蒽(benzanthronil)、曙紅、乙酰丙酸衍生物、膦衍生物、單酰基-和雙酰基膦、金屬茂、苯乙酮、二苯甲酮、呫噸酮、醌、酮衍生物、羥基酮、氨基酮、過氧化苯甲酰、吡啶鹽、苯基乙醛酸鹽和/或碘鎓鹽。

除了自由基形成劑之外，還優選使用乙烯基大分子單體和胺基共引發劑，以使光聚合過程特別合適。合適的共引發劑的實例包括抗壞血酸和叔胺衍生物如甲基二乙醇胺或四乙胺。

在一個變型中，可光聚合液體包含硫醇衍生物。合適的硫醇衍生物是二硫蘇糖醇、單功能半胱氨酸、雙功能肽和類似化合物。

此外，可以將物質添加到抑制更深、更多液體層的光聚合的可光聚合液體中。這使得在焦平面以外的液體溶液保持液體，即使它位于在它上方的焦平面的照射區域中。這是由物質的聚合波長的吸收引起的。攔截發生在焦平面中，使得聚合波長不可能穿透更深的層。以所希望的波長吸收的所有物質(如染料)都是合適的。

在另一變型中，可光聚合液體包括單官能單體如n-乙烯基吡咯烷酮。

此外，在一個變型中可能的是對于第一可光聚合液體和/或另外的可光聚合液體和/或不必需是可光聚合的另一種液體之一包含溫度敏感膠凝劑。特別地，提供了反向溫度敏感(也稱為逆向溫度敏感)膠凝劑的使用。這樣的膠凝劑隨溫度升高而變得越來越堅固。在加熱反應容器時，反應液體固化并形成最初只有亞穩的凝膠。如果液體不能同時光聚合，則物體的后續冷卻可導致亞穩凝膠再次變得液化并被泵送離開。在常用的溫度敏感膠凝劑中，待使用的溫度條件恰好相反。根據需要，因此，例如可以構造支撐結構，使得可以生產懸掛結構。相比之下，如果亞穩凝膠至少部分地用適當波長的光照射，則這導致光聚合，使得亞穩凝膠在這些區域中被轉化為穩定的凝膠或聚合物。

換句話說，通過溫度敏感的、特別是反應溫度敏感的膠凝劑和反應空間的溫度控制，變得可以更簡單地用懸掛部分和底切進行工作。然而，在這種變型中，甚至用液體結構作為支撐物人們也可繼續工作。

也可以提供溫度梯度，使得在液體與溫度敏感的、特別是反向溫度敏感的膠凝劑混合的所有區域中不發生亞穩凝膠。通過使用這種梯度，可以生產甚至更復雜的結構。

上述單獨組分可以作為單獨物質包含在可光聚合液體中。可替代地，也可以通過相應的合成來實現在單一聚合物中優選地用于凝膠形成的物質或基團。代替單獨組分的混合物，這樣的聚合物然后將包含組合所有所需功能或優選用于光聚合的功能的不同官能團。此外，還可以想到僅提供優選用于在一種聚合物中的光聚合的官能團或基團的一些，并將優選用于光聚合的其他官能團或基團混合到可光聚合液體的分離的單獨組分中。

作為用于三維多細胞物體的結構的生物細胞，所有天然存在的真核細胞和原核細胞都是合適的。所使用的細胞優選為真核細胞。特別好地適合的是在哺乳動物、特別是嚙齒動物并且特別優選人類體內存在的，或構成該體的所有細胞和細胞類型。在一個變型中，所用的生物細胞是全能或多能細胞。在此，本發明在一個變型中僅涉及可以在不破壞人胚胎的情況下獲得的那些細胞的用途。除了天然存在的細胞外，非天然存在的細胞系的細胞也可以用作生物細胞。這樣的人工生成的細胞系使得能夠生產三維多細胞物體的定制結構。

由于本發明方法使得可以將各種細胞類型組合成三維多細胞物體，所以它特別好地適用于人造器官的生產。例如，這樣的人造器官可以是天然存在的器官，特別是人或動物如哺乳動物或嚙齒動物的天然存在的器官的小型化模型物體。由于可以使用不同的可光聚合液體，所以其中嵌入生物細胞的不同凝膠類型也是可能的。還可以組合合成聚合物和生物聚合物，使得可以生產其中嵌入生物細胞的高度穩定的構建物。在單次印刷操作期間，可以同時生產甚至具有不同形式的多個三維物體。

此外，膜和屏障功能與器官功能的組合也使得可以使用該技術來模擬妊娠的模型。

在一個變型中，所生產的人造器官特別是模擬肌肉、骨骼、皮膚、脂肪組織、腸、肝、骨髓、腦、肺、心臟、腎臟、甲狀腺或脾臟的功能的器官并且因此可以稱為人造肌肉，人造骨骼等。

在反應容器內的載體上，或還在不同的反應容器中，可以提供例如在相同印刷操作期間生產的不同人造器官的組合。

在一個變型中，直到反應容器中預先存在的可光聚合液體(例如這可以是第一可光聚合液體或另外的可光聚合液體)已經從反應容器中移除才將另外的可光聚合液體引入反應容器中。為此目的，例如，可以提供將已經使用的可光聚合液體泵出反應容器并將新的另外的可光聚合液體泵送到反應容器中的泵。對于這樣的過程，也可以使用兩個或更多個不同的泵代替一個單獨的泵。

在一個變型中，可以想到并提供用于將消毒液引入反應容器中以便允許三維多細胞物體的無菌生產。當先前使用的可光聚合液體已經從反應容器中移除并且另外的可光聚合液體還尚未引入反應容器中時，可以例如將這樣的消毒液引入反應容器中。此外，還可以想到除了可光聚合液體之外，將消毒液引入反應容器中，使得其在光聚合過程期間被包含在反應容器中。

作為消毒液，例如，可以使用諸如乙醇或丙醇的醇。在此，其中醇濃度例如在40％至90％、特別是50％至80％、并且非常特別是60％至70％(分別地v/v)的范圍內的那些醇的水溶液特別適合于消毒。

在一個變型中，在其生產過程期間或結束時，多細胞三維物體可以用短波長的光(例如在uv區域中，即小于380nm)照射以便以這種方式實現滅菌。這樣的uv滅菌通常是已知的。然而，在本發明的情況下，如果包含在三維物體中的生物細胞不會被這種uv輻射損壞，則可以有利地使用它們。

在一個變型中，載體板或載體結構被安排在第一聚合結構結合在其上的反應容器中。在所生產的三維多細胞物體稍后不在反應容器本身中進行研究、而是要從反應容器中移除的情況下，這種載體板的使用是可取的。例如，螺釘端子(例如din螺釘端子)可以存在于載體板中，以便允許隨后向所生產的多細胞三維物體供應液體和氣體。也可以在生產過程期間將這樣的螺釘端子引入三維多細胞物體的基質中，即在所述過程期間在基質中產生螺釘端子。無論是否使用載體板，可以進行在基質中生產這樣的螺釘端子。

在一個變型中，在通過在位于反應容器的填充有可光聚合液體(特別是填充有第一或另外的可光聚合液體之一)的區域內的焦平面中用光束照射來生產第一聚合結構的步驟之前，通過形成包含或構成載體板的聚合載體結構來生產載體板。這意味著在該變型中，通過聚合反應不僅生產實際的聚合結構，而且還生產載體結構。

載體結構可以具有使得在載體板與反應容器的底部之間產生距離的形式。這然后使得實際聚合反應的焦平面在距離反應容器的底部更大的距離處。特別地，第一形成的聚合結構然后在距離反應容器的底部更大的距離處。這使得可以特別容易地從反應容器中抽出不再需要的可聚合液體。

這樣使得液體能夠容易地穿過載體板或載體結構，載體結構可以配備有液體可滲透的開口，特別是在載體板的區域中。

在一個變型中，光學系統被安排在用于產生第一和/或另外的光束的光源與反應容器之間，所述光學系統用于將光束聚焦在反應容器中的相應的焦平面上。在此，在一個變型中提供了可以進行這種光學系統的重新聚焦，以便改變反應容器內的焦平面。例如，這種重新聚焦可以通過改變光學系統與光源的距離來實現。在此，可以提供計算機控制的步進電動機，以便提供光學系統的相應運動。光學系統可以例如包括光學透鏡或者-在特別簡單的結構的情況下-單獨的聚焦透鏡的系統。

當進行光學系統的重新聚焦以便改變或移動反應容器內的焦平面時，反應容器的結構通常沒有特別的要求。

在一個變型中，還可能在一方面反應容器或安排在反應容器中的載體板與另一方面用于產生第一和/或另外的光束的光源之間進行相對運動。原因是通過這樣的相對運動，其可以例如通過反應容器的運動、安排在反應容器中的載體板的運動或光源的運動來進行，也可以改變反應容器內的焦平面。因此，在該變型中，不需要任選使用的光學系統的重新聚焦。以這種方式，可以降低光學不對準的風險。

在另外的變型方法中，將該第一和/或該另外的光束引導到在該第一可光聚合液體和/或該另外的可光聚合液體內的相應焦平面中的限定的和可預定的區域上。這意味著可以預先確定特定的光圖案，該光圖案撞擊可光聚合液體并且在這些位置誘導液體的聚合以形成聚合物或凝膠(基質)。例如，這種光圖案可以通過使用掩模或屏幕，而且還通過使用脈沖光束或光信號的數字調制來產生。在由光束撞擊的可光聚合液體的區域發生聚合。然而，在未被光束撞擊的其他區域，可光聚合液體保持其未聚合狀態。因此，光束限定了其中發生聚合結構的印刷的區域。這種光支持的印刷使得可以實現比使用現有技術已知的方法可能的高得多的分辨率。在此，分辨率取決于所使用的光的波長。即使在經常使用的長波長的情況下，其優于使用現有技術已知的常規方法可以實現的分辨率。光源可以聚焦地越精確，所得到的分辨率越大。例如，可以使用激光器實現極高的分辨率。

根據需要，可以使用反射鏡將光束引導到相應的焦平面上。分別選擇的曝光圖案可以例如由計算機程序來提供。在此，可以想到用戶通過cad程序生成要生產的三維物體。以這種方式生產的數字物體然后通過合適的計算機程序分成單獨的曝光平面。此外，指定的可光聚合液體或指定的細胞類型被分配給每個平面或這樣的平面的不同區域。基于這些數據，為打印機準備控制數據，通過這些控制數據進行所描述的方法。這些控制數據指定何時以及什么可光聚合液體必須被引入反應容器中。此外，這些控制數據指定何時和曝光平面的什么圖像被投影到反應容器中的相應的焦平面上。以這種方式，先前在計算機上產生的數字物體可以被轉換為真正的三維多細胞物體。

在一個變型中，在同一層中(即，在同一焦平面中)生產多于一個聚合結構。為此，首先發生第一可光聚合液體的聚合和例如第一細胞類型嵌入由第一液體形成的聚合物中。此后，將第一可光聚合液體從反應容器中移除，并將第二可光聚合液體進料到反應容器中。現在暴露以前尚未暴露并且因此還沒有顯示出任何聚合結構的只有在反應容器中的焦平面內的區域。這使得可以在同一層中生產不同的細胞類型或不同的基質。因此，在同一層中形成多個聚合結構，這導致非均質層。此后，將第二可光聚合液體從反應容器中移除，并將另外的可光聚合液體進料到反應容器中。該另外的可光聚合液體的填充水平只能達到這樣的水平使得先前形成的層被完全覆蓋。然后可以移動焦平面，并且可以通過相應的聚合結構來構造待生產的三維多細胞物體的另外的層。在這種情況下，通常可以的是對于所生產的三維物體的單獨層是均質的(包括單一類型的聚合結構)，并且對于其他層是非均質的(包括不同類型的聚合結構)，其中每層的單獨結構的數量不受限制。在實踐中，除了每層單個聚合結構外，已經發現具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個聚合結構的非均質構成的層是有利的。

在一個變型中，第一層中的至少第一結構，但特別是第一層的每個結構，都是用第一光束從兩個不同的方向照射的。在此，這兩個不同的方向優選彼此相對。這種來自兩個不同方向的照射提供了第一層在反應容器的內表面上或安排在反應容器中的載體板上的特別牢固的錨定。這允許實現所生產的整個三維多細胞物體與反應容器或反應容器中的載體板的隨后牢固粘附，這有利于物體的后續研究。典型地，在頂部開放的反應容器中從上方進行照射。在該變型中，優選地，第一層然后還從下方照射通過反應容器的底部。為此，反應容器必須由對選定波長的光束可透過的材料制成。安排在第一層上方的隨后層然后進而優選地僅從一個方向(即，優選地從上方)照射，使得已經形成的聚合結構不位于光束的焦平面與用于發射光束的光源之間并且因此在其焦平面之前不再被光束照射。

在一個變型中，第一光束和/或另外的光束具有在200nm至1000nm范圍內的波長(即在uv區域與紅外區域之間的波長)。優選用作自由基形成劑的物質可以通過這樣的波長被特別有效地激發，導致形成自由基以允許帶有丙烯酸酯官能團的起始物質的聚合。

所使用的光束的進一步合適的波長在250至950nm、特別是300至850nm、特別是350至800nm、特別是400至750nm、特別是450至700nm、特別是500至650nm、并且特別優選500至600nm的范圍內。

由于uv光可以損害生物細胞，在一個變型中，只使用具有可見光區域中的波長(即約380nm至約780nm)的光。在這種情況下也可以提供從光束中濾出uv組分的uv濾光片，以便將可能有害的uv照射從所使用的光束安全地過濾出。

用于聚合的光束可以具有相同的波長，但是可以可替代地包括與上述波長范圍不同的波長，以便允許各種可光聚合液體的適當聚合。在此，單獨光束可以由不同的光源或由同一個光源產生。也可以在一層內(并因此在一個焦平面內)連續使用不同的波長以便在同一層中聚合不同的可光聚合液體，如果非均質層要由不同的聚合結構形成的話。

在一個變型中，進行該方法使得在三維多細胞物體的生產期間，將至少一個功能元件引入到三維多細胞物體中。在這種情況下，該功能元件選自下組，該組由以下各項構成：膜、通道、孔、傳感器、導電載體和趨化性制劑。例如，通過使在彼此頂上的多個層中形成的聚合結構的某些區域暴露，可以將通道和孔結合到物體中。

可以通過將脂質分子引入可光聚合液體中來形成膜。

此外，通過光聚合，也可以在物體內引入鹽橋。如果可光聚合液體含有鹽，即是鹽水，則這可以以特別簡單的方式進行。以這種方式，可以進行印刷物體的隨后的放電和削弱。

通過在生產過程期間安裝在物體中的傳感器，不需要對所生產的三維物體的后續進一步操縱，因為它可以通過已經安裝的傳感器直接讀取。這實質上有助于三維物體的后續分析。

通過引入諸如電極的導電載體，在所形成的三維多細胞物體的后續研究中分析物體的電位或電特性是特別簡單的。

通過引入趨化性制劑，其在一個變型中可以以不同的濃度引入不同層中以便因此形成梯度，在其生產后在多細胞三維物體內進行細胞的靶向生長變得可能。如果趨化性制劑是引誘劑，則其發揮積極的趨化性，使得三維物體中的細胞被定向為朝向引誘劑的較高濃度的區域。如果趨化性制劑是驅避劑，則其發揮消極的趨化性，使得三維物體中的細胞被定向為朝向驅避劑的較低濃度的區域或其中根本不存在驅避劑的區域。這使得可以實現多細胞物體內的細胞的目標生長。

優選使用至少一個填充水平傳感器來恒定精確地測定反應容器中的液面。基于該填充水平數據，然后可以確定其中應進行下一個聚合步驟的焦平面。由這種填充水平傳感器提供的數據也可用于自動調整焦平面。由填充水平傳感器提供的數據也可用于控制提供可光聚合液體進入反應容器的流入的泵。這使得可以總是向反應容器中引入形成特定時間希望的層準確量的所需的可光聚合液體。這將浪費的量保持在最小。此外，這使得可以以經濟的方式進行整個方法。

如從在此所描述的方法的以上陳述可以看出，該方法可以以完全自動的方式進行，使得不需要用戶的動作。這使得該方法甚至更容易使用。

期間光束被引導到相應的焦平面上的時間可以被調整到所使用的可光聚合液體的相應要求。這意味著允許每種材料的對于所希望的聚合所需的并且有利的固化時間。

如果載體被安排在反應容器內，當該載體相對于反應容器提升時，可以在周圍的流化床與載體上的已經聚合的結構之間產生負壓。然而，通過從先前的聚合步驟中抽出仍然存在于反應容器中的可光聚合液體的殘余物并引入新的可光聚合液體，可以釋放潛在占主導的負壓。由于這個原因，載體可以相對于反應容器移動，而沒有將三維物體的已經聚合的結構從該載體撕裂開的風險。

如果三維物體在載體板上生產，則在生產過程結束后，該載體板可以完全從反應容器中的剩余液體中提出。此后，所生產的物體可以由使用者從載體板移除。為了防止物體在從載體板移除時被破壞，載體板可以構造成使得無菌空氣流能夠在載體板的表面與所生產的三維物體的下側之間被引導。這然后允許物體從載體板上均勻地按壓離開，從而確保三維物體從載體板上輕輕地移除。

本發明的目的還通過一種用于由具有以下特征的可光聚合液體生產三維多細胞物體的裝置來實現。

這種裝置包括反應容器和光源，其被安排成使得在裝置的操作期間，其可以將光照射到反應容器中，其中該光聚焦在反應容器內的焦平面上。該裝置進一步包括用于不同的可光聚合液體的儲存器。此外，提供能夠與儲存器和反應容器二者流體連通的泵。為此目的，可以在泵與儲存器之間或在泵與反應容器之間提供合適的閥。這使得可以通過泵將這些不同的可光聚合液體引入反應容器中并將它們從反應容器中排出。最后，還提供了用于控制光源和泵的控制單元。

已經結合上述方法的解釋呈現了該裝置的單獨元件的基本功能。

如果反應容器是微量滴定板的孔，則在一個變型中，可以提供可通過各種閥控制的多條不同的管線，使得可以同時填充或排空不同的反應容器。此外，還可以提供可以移動到微量滴定板的各個孔的單個填充或抽吸裝置。

從反應容器中供應和/或移除可光聚合液體優選在接近底部的反應容器的區域中進行。這是因為以這種方式，一方面可以確保即使殘留量的待移除的可光聚合液體也能從反應容器中移除。此外，以這種方式，可以確保新的可光聚合液體到反應容器中的溫和供應，使得已經聚合的結構不會被新供應的液體損壞。

在一個變型中，光源被提供和配置成發射不同波長的光。在這種情況下，待發射的光的波長可以由用戶或控制程序預先確定。這允許實現不同的聚合波長，而不必為此目的使用不同的光源。

在一個變型中，提供至少一個反射鏡以便將第一和/或另外的光束引導到可光聚合液體上。以這種方式，可以實現光源和反應容器的甚至更多不同的安排。

上述裝置特別好地適用于生產人造器官或妊娠模型，如上面在那里描述的方法的概述中已經描述的。在此，人造器官可以是健康器官模型或疾病模型。

在此描述的方法的優選或替代實施例類似地適用于所描述的裝置或用途，并且反之亦然。在此，可以想到并提供單獨變型的任何希望的組合。

現在將基于說明性實施例和相應的附圖更詳細地說明本發明的進一步細節。附圖示出以下：

圖1用于從可光聚合液體生產三維多細胞物體的裝置的第一說明性實施例，

圖2用于從可光聚合液體生產三維多細胞物體的裝置的第二說明性實施例，以及

圖3其中印刷載體結構的變型方法的說明性實施例。

圖1示出了作為用于從可光聚合液體生產三維多細胞物體的裝置的3d打印機的示意性結構。該3d打印機包括第一光源1和第二光源2。由第一光源1發射的光通過第一透鏡3被引導到多個反應容器4上，其中僅三個在圖1的圖示中示出。以相同的方式，由第二光源2發射的光通過第二透鏡5被引導到反應容器4上。代替兩個不同的光源1、2，也可以使用單個光源，其中光束路徑然后將被配置成使得由該單個光源發射的光將任選地從反應容器4的上側和/或從反應容器4的下側被引導到反應容器4上。

第一光源1和第二光源2可以發射不同波長的光，其中波長可以被自動地調節。

將分別含有作為可光聚合液體的不同起始液體的多個不同的室6組合以形成儲存器7，其通過與室6的數量相對應的多條管線8連接到泵9。通過泵9，包含在儲存器7的室6中的可光聚合液體可以經由管線8被輸送到反應容器4。為此目的，反應容器4通過相應的管線系統10連接到泵9。泵9進一步連接到廢物容器11，不再需要的液體殘余物可被進料到該廢物容器中。具體地，泵9還用于經由管線系統10從反應容器4抽出不再需要的可光聚合液體并且然后將其進料到廢物容器11中。

在圖1所示的3d打印機的操作中，首先將通過cad程序生成的數字物體12上的數據發送到中央控制單元13。在該中央控制單元13中，將數字物體12分解成單獨平面然后可以發生，前體是這尚未通過發送的數據發生。在這種情況下，中央控制單元13用于激活第一光源1、第二光源2和泵9。此外，如果這是用戶希望的話，第二透鏡5也可以由中央控制單元13移動。現在，通過泵9從儲存器7的相應室6中抽吸已經包含待引入第一層的細胞的待生產的三維物體的第一層所需的可光聚合液體并經由相應的管線8和管線系統10輸送到單獨的反應容器4。此后，將來自第一光源1的光和來自第二光源2的光二者聚焦在反應容器4上，使得位于反應容器4中的可光聚合液體的聚合發生，并且由此形成的聚合結構牢固地粘附到反應容器4的內側。此后，剩余的未聚合液體通過泵9經由管線系統從反應容器4中抽出并進料到廢物容器11。

根據由中央控制單元13預先確定的數據，現在通過泵9從儲存器7的相應室6中抽吸另外的可光聚合液體并經由相應的管線8和管線系統10再次供應到反應容器4。中央控制單元13現在使入射到反應容器上的光的焦平面變化。為此目的，中央控制單元13激活電動機14，該電動機使反應容器4降低與第一步驟中生產的第一層的聚合結構的厚度對應的高度。來自第一光源1的光現在從上方照射到反應容器4上以便生產第二層聚合結構，其在第一層的正上方形成并通過化學反應共價結合到第一層上。

該步驟不再需要第二光源2，因為僅對底層進行雙面照射，因為該層要特別牢固地粘附到反應容器4的內側。此后，尚未聚合的液體再次從反應容器4中泵出，并且根據由中央控制單元13預先確定的值將另外的可聚合液體引入反應容器4中。然后再次降低反應容器4，使得焦平面改變并且可以形成另外的層。重復這些步驟直到生產所希望的三維物體。

如上所討論，多個聚合步驟也可以在此在相同的層中連續地進行，以便生產不同聚合結構的非均質層。此外，可以從相同的可光聚合液體生產不同的連續層。在這種情況下，不需要在第一聚合過程中從反應容器4中抽出尚未聚合的液體。相反，反應容器4可以簡單地降低以改變焦平面，使得然后使用仍然存在于反應容器中的可光聚合液體的剩余部分在預先形成的層上生產另外的聚合結構層。

此外，中央控制單元13還用于激活溫度調節單元18，其可以冷卻和/或加熱反應容器4或反應容器4和/或儲存器7和/或儲存器7的室6周圍的空間，以提供限定的反應條件。溫度調節單元18使得可以以特別簡單的方式使用溫度依賴性膠凝劑并形成溫度依賴性亞穩凝膠。

圖2示出了作為用于從可光聚合液體生產三維多細胞物體的裝置的另外的說明性實施例的另外的3d打印機。在此，相同的元件用與圖1中相同的參考符號指定，在此方面參考關于圖1的以上說明。

圖2所示的3d打印機與圖1所示的3d打印機的不同特別在于反應容器4的構造。具體地，在圖2所示的3d打印機中，載體板15被安排在用作待生產的三維物體的基材的反應容器4內。在此，用來自第一光源1的光的照射從反應容器4的下側進行。這意味著在反應容器4內生產具有面向下的上側的待生產的三維物體。待生產的物體的底層首先在載體板15上聚合。此后，通過電動機14提升載體板15，使得然后在已經粘附到載體板15的層上生產下一層。這意味著在這種情況下，通過載體板15的提升來移動從光源1向反應容器4輻射的光的焦平面。在此，載體板15僅被提升這么遠使得已經形成在其上的聚合結構層剛好接觸位于反應容器4中的可聚合液體16的表面。當來自光源1的光然后被輻射到反應容器4中時，由此形成的聚合結構的另外的層直接沉積在已經預先生成的層上，因此可以發生彼此兩層的共價結合，從而為最終生產的物體賦予高的穩定性。

由于僅為圖2的3d打印機提供單個反應容器4，將泵9連接到反應容器4的管線系統10也僅是單個管線。

為了使載體板15上生產的物體容易地從載體板15可移除，還提供了無菌空氣壓力源16，其可以通過空氣壓力管線17與載體板15流體連通。當三維物體的生產完成時，可以通過在載體板15的下側與所生產的物體的第一層之間的無菌空氣壓力源16強制空氣，使得物體可以容易地從載體板15上移除。

在圖1的說明性實施例和圖2的說明性實施例二者中，除了以上提及的功能之外，中央控制單元13還用于控制由光源產生的圖像或圖案、曝光的持續時間、反應容器4或反應容器4內的載體15的高度、焦平面、反應容器4內的可光聚合液體16的填充水平、可光聚合液體的選擇和/或設置在管線8和管線系統10中的閥。以這種方式，3d打印機可以完全自動地操作并且基于相應提供的數據生產三維物體而不與用戶交互。

如在圖1的說明性實施例中，提供了溫度調節單元18。在此方面參考上述說明。

通過下面說明的進一步說明性實施例，提出了所用的可光聚合液體的可能的溫度敏感性。

通過添加溫度敏感物質，特別是反向溫度敏感物質，可以進一步提高懸掛物體和中空室的產生。例如，物質如泊洛沙姆可以在此以這樣的濃度混合，使得可光聚合液體或不可光聚合液體即使在沒有光照射的情況下也在所希望的溫度范圍內凝膠化。

例如，該方法的過程可以如下：如果凝膠化要在大約20℃的溫度下實現，將泊洛沙姆以這樣的濃度混合到可光聚合液體中使得該液體在該區域中凝膠化。多種泊洛沙姆的混合物也是可能的。如果可能，液體首先可以冷卻到低于凝膠點的溫度。如果希望物體內的懸掛結構，則可以將含有溫度敏感膠凝劑的液體加熱到高于膠凝溫度的溫度。液體然后凝膠化。與此同時，液體也可以光聚合。如果溫度敏感液體的區域沒有光聚合，則該液體在升高的溫度下將是固體，但是可以通過將溫度降低到低于凝膠化溫度在任何時候再次液化。因此，溫度敏感的凝膠化組分可以起支撐結構的作用，直到印刷過程結束。在印刷完成后，溫度可以再次降低到以上提及的說明性凝膠化溫度的20℃以下。其結果是，液體的非聚合的溫度敏感部分再次液化并可以被泵送離開。如果凝膠液化，則移除支撐結構，并且現在光聚合的印刷物體的以前支撐的部分自由懸掛。

圖3示出了在反應容器4中印刷的物體19。印刷物體19由多個疊加的聚合結構20、21、22構成，它們僅在圖3的圖示中示意性地示出。底部聚合結構在用作載體板的平臺23上形成。平臺23通過中央安排的支架24連接到反應容器4的底部。支架24在平臺23與反應容器4的底部之間提供距離a。

平臺23和支架24一起形成載體25，其也可以被稱為載體結構。孔26在平臺23中形成，液體可以通過這些孔流到反應容器4的底部。液體然后可以以特別簡單的方式通過管線系統10被抽出(在這方面也參照圖1和2)。以這種方式，此外，新鮮液體可以通過管線系統10簡單地引入反應容器中并且良好地分布，因為底部聚合結構20然后不阻礙液體分布。

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