基于數字微鏡器件的快速精準光學聚焦增強方法與系統與流程

本發明屬于光遺傳學與光學顯微成像領域，特別涉及了一種基于數字微鏡器件的快速精準光學聚焦增強方法與系統，并應用于光遺傳學光刺激與光學顯微成像。

背景技術：

在生物醫學光學領域，光學散射是制約光學成像質量的主要因素。多數深部組織成像的光學技術(例如，激光共聚焦成像，雙光子顯微鏡和光學相干層析掃描)主要利用非散射光子(即彈道光子)成像。彈道光子的數量隨深度增加呈指數式衰減，因此將光束聚焦范圍限制在了1mm的深度。

光遺傳學技術需要對特定的神經元進行光刺激，以研究其神經環路機理。但是傳統的光纖植入式光遺傳學對活體生物的損傷嚴重，不利于長期研究。早先應用在天文學中的自適應光學技術，為實現深層生物組織光刺激與成像提供了新的技術支持。

現有的非侵入式自適應光遺傳學技術是基于自適應光學的精確相位校正技術，或基于相干光自適應技術來進行相位補償的。精確相位校正技術通過將空間光調制器分成若干分區，依次等間隔改變分區內的光束附加相位，探測其最佳光束聚焦相位。每個分區依次循環迭代，從而獲得最終校正相位，對入射光束進行相位補償，從而校正其畸變相位，形成良好光束聚焦。

但是以上精確相位校正需要消耗大量的時間，為了獲得更好地光學校正，就需要劃分更多的分區與更細的相位間隔。由于空間光調制器的圖像刷新率較低，導致光學校正消耗大量時間。

相干光自適應技術也是將空間光調制器分成若干分區，利用分塊可變形鏡或數字微鏡器件對入射到空間光調制器上的光束進行快速強度調制，從而利用各光束相干得到的光強值計算出不同分區對應的光束所需的補償相位，然后再將相位加載到空間光調制器上進行光束補償。

雖然利用相干光自適應技術能夠有效地縮短校正光束相位的時間，但是依舊無法克服空間光調制器加載相位進行校正所消耗的時間，不利于活體生物中進行實時光遺傳學刺激與研究，制約了自適應光遺傳技術的推廣。

技術實現要素：

為了解決背景技術中存在的問題，本發明目的在于利用圖像刷新率較高的數字微鏡器件解決傳統自適應光遺傳學中空間光調制器耗時較長的問題。利用數字微鏡器件快速的刷新率，從光學衍射原理出發，將光束分為若干區域，借鑒相干光自適應技術的快速補償相位探測技術，通過區分不同相位對光束聚焦中心的干涉作用，將對聚焦中心干涉相長的區域保留，并去除對聚焦中心干涉相消的區域，從而提升了光束聚焦的質量，省去了利用空間光調制器加載補償相位所消耗的時間，縮短了自適應光刺激的校正時間。

為了實現上述目的，本發明的技術方案包括以下步驟：

一、一種基于數字微鏡器件的快速精準光學聚焦增強方法：

1)物鏡的焦平面處不放置實驗樣品，用無加載分區的數字微鏡器件進行光束聚焦，在物鏡的焦平面處得到理想聚焦光斑，記錄理想聚焦光斑的聚焦中心位置of；

2)將實驗樣品置于物鏡的焦平面處，用無加載分區的數字微鏡器件進行光強探測，記錄獲得聚焦中心位置of的光強值；

3)將數字微鏡器件的反射面分為多塊區域，并將所有區域分為兩個部分；

每個部分中的各個區域可以是相連通的，也可以是不連通，即棋盤格類似的等分方式。

4)針對每一部分的各個區域以強度調制方式進行光強探測，獲得每一部分對應記錄到的聚焦中心位置of處的一個光強值，并處理獲得每一部分中各個區域對應的補償相位值；

5)將每一區域的補償相位值與π進行比較，并采用以下方式處理得到篩選結果：

若補償相位值小于等于π，則該光強值對應的區域保留；

若補償相位值大于π，則該光強值對應的區域去除；

6)將根據篩選結果調整分區并加載到數字微鏡器件上進行光強探測，在實驗樣品內形成最終光學聚焦增強光斑，在聚焦中心位置為of處激發出更強的熒光。

所述步驟1)中的光束聚焦具體是：激光器發射出光束，經過準直擴束后，在數字微鏡器件上反射，然后經過物鏡聚焦。

所述步驟2)、4)和6)中的光強探測具體是：激光器發射出光束，經過準直擴束后，在數字微鏡器件上反射，然后經過物鏡聚焦到樣品上，樣品帶有熒光材料，在樣品內產生畸變散射光斑并激發出熒光，激發出的熒光再經透鏡聚焦后由光電倍增管和振鏡配合進行掃描探測獲得散射光斑激發出的熒光圖像，記錄聚焦中心位置of的光強值。

所述的熒光材料包括熒光蛋白、熒光小球或者熒光染料。

所述實驗樣品為但不限于活體生物組織、離體生物組織、含小球的瓊脂塊等。

所述步驟3)中將數字微鏡器件的反射面分為多塊區域具體是指將數字微鏡器件的微鏡像素元以n×n方式均勻分區，從而將準直擴束后的入射光束分為對應的n×n個光束單元。

所述步驟4)具體為：在光強探測時，保持第一部分內各個區域的反射面不變，將第二部分內各個區域的反射面同時以不同的頻率進行來回偏轉，不同區域具有不同的來回偏轉的頻率，由時間長持續不斷地來回偏轉形成對不同分區的光束進行不同頻率的強度調制，對調制后的光束進行光強探測；將探測得到的光強值做傅里葉變換并繪制頻率-幅值圖，由頻率-幅值圖中不同區域的調制頻率對應的光強幅值進行轉換計算為補償相位，從而得到第二部分內不同區域所需的補償相位值。

反之處理，保持第二部分內各個區域的反射面不變，將第一部分內各個區域的反射面同時以不同的頻率進行來回偏轉，能計算得到第一部分內不同區域所需的補償相位。

所述步驟4)具體是指將多個區域等分為無共同分區的兩個部分，根據奈奎斯特采樣定律選擇每個部分合適的調制頻率范圍，并且設置每個部分中的每個分區有不同的強度調制頻率，每個部分所有分區對應的強度調制頻率能覆蓋到該部分的調制頻率范圍。

然后在光強探測時，保持某一部分的區域的反射面不變，另一部分內的各區域的反射面同時以對應的不同頻率進行振動，使得每個區域的反射面產生的光束以設置的頻率在正側光路與旁側光路之間來回偏轉，旁側光路將光束阻擋，正側光路為未進行強度調制前反射面產生光束的光路，從而對不同分區的光束進行不同頻率的強度調制。

所述步驟6)根據篩選結果調整分區具體是：經過數字微鏡器件時，篩選后去除的區域將自身接收入射光束后產生的反射光束調整反射角度，使反射光束到旁側光路，同時篩選后保留的區域保持反射光束的反射角度與所述步驟2)光強探測時反射光束的反射角度相同。

二、一種基于數字微鏡器件的快速精準光學聚焦增強系統：

系統包括激光器、光纖、準直透鏡、數字微鏡器件、光擋、縮束模塊、掃描模塊、二向色鏡、顯微物鏡、實驗樣品和光強探測模塊。光纖和準直透鏡布置在激光器之后，激光器發射出光束經光纖傳輸之后通過準直透鏡入射到數字微鏡器件，數字微鏡器件旁側出射端置有光擋，數字微鏡器件前側出射端置有縮束模塊，前方設有二向色鏡；光束經二向色鏡反射后經過掃描模塊進入顯微物鏡聚焦，實驗樣品位于顯微物鏡焦平面上；實驗樣品內激發出的熒光經過顯微物鏡與掃描模塊后透過二向色鏡被光強探測模塊接收進行光強探測。

所述的縮束模塊包括前縮束模塊透鏡和后縮束模塊透鏡；前縮束模塊透鏡和后縮束模塊透鏡依次平行布置在數字微鏡器件的正側，數字微鏡器件反射的光束依次經前縮束模塊透鏡和后縮束模塊透鏡平行縮束后入射到二向色鏡的旁側。

所述的掃描模塊包括前掃描振鏡、前光束準直透鏡、后光束準直透鏡、后掃描振鏡、前掃描模塊透鏡和后掃描模塊透鏡；前掃描振鏡、前光束準直透鏡、后光束準直透鏡、后掃描振鏡、前掃描模塊透鏡和后掃描模塊透鏡依次布置在二向色鏡的前側，二向色鏡反射的光束依次經前掃描振鏡、前光束準直透鏡、后光束準直透鏡、后掃描振鏡、前掃描模塊透鏡和后掃描模塊透鏡后入射到顯微物鏡。

所述的光強探測模塊包括光學濾波器、準直聚焦透鏡、光纖、聚焦透鏡和光電倍增管；光學濾波器、準直聚焦透鏡、光纖、聚焦透鏡和光電倍增管依次布置在二向色的后側，實驗樣品發出的熒光依次經顯微物鏡、后掃描模塊透鏡、前掃描模塊透鏡、后掃描振鏡、后光束準直透鏡、前光束準直透鏡、前掃描振鏡、二向色鏡、光學濾波器、準直聚焦透鏡、光纖和聚焦透鏡后進入光電倍增管進行光強探測。

本發明的有益效果是：

本發明利用數字微鏡器件實現了快速的自適應光束聚焦增強，利用數字微鏡器件快速的圖像刷新速率，克服了以往利用空間光調制器進行相位校正時速度慢的問題，提升了光束聚焦與光學刺激的速度。

本發明基于光學衍射成像原理，通過將數字微鏡器件與相干光自適應技術結合，篩選出對聚焦光斑有干涉相消作用的分區光束并將其去除，從而使得聚焦中心的光強顯著提升，提高了自適應光束聚焦質量。

本發明使用數字微鏡器件進行自適應光束增強，取代了昂貴的空間光調制器，在保證光束聚焦的同時降低了實驗成本，更利于方法與系統在研究實驗中的應用。

并且本發明可方便地與已有的各種顯微成像技術相結合，實現同步的光刺激與顯微成像，有利于基于光遺傳學對行為學與神經環路等面向大腦不同區域的研究發展。

附圖說明

圖1為本發明系統的結構示意圖；

圖2為實施例中無數字微鏡器件篩選時的散射聚焦光斑圖像；

圖3為實施例中數字微鏡器件第一部分分區所施加的調制頻率示意圖；

圖4為實施例中數字微鏡器件第二部分分區所施加的調制頻率示意圖；

圖5為實施例中光電倍增管探測到的強度調制后的部分熒光光強值；

圖6為實施例中熒光光強值作傅里葉變換之后的部分頻率-幅值圖；

圖7為實施例中從熒光光強值中計算得到的部分分區補償相位值；

圖8為實施例中數字微鏡器件第一部分分區所需補償的分區分布圖；

圖9為實施例中數字微鏡器件第二部分分區所需補償的分區分布圖；

圖10為實施例中數字微鏡器件所需去除的光束分區分布圖；

圖11為實施例中數字微鏡器件加載篩選分區后的光束聚焦光斑圖像。

具體實施方式

以下自適應光束聚焦增強實施例可以更詳細的說明本發明，但不以任何形式限制本發明。

本發明的實施例及其具體過程如下：

如圖1所示，本發明系統包括激光器1、光纖2、準直透鏡3、數字微鏡器件4、光擋5、前縮束模塊透鏡6、后縮束模塊透鏡7、二向色鏡8、前掃描振鏡9、前光束準直透鏡10、后光束準直透鏡11、后掃描振鏡12、前掃描模塊透鏡13、后掃描模塊透鏡14、顯微物鏡15、實驗樣品16、光學濾波器17、準直聚焦透鏡18、光纖19、聚焦透鏡20和光電倍增管21。

(1)激光器1發出的光束依次經過光纖2和準直透鏡3后，照射到數字微鏡器件4上。在數字微鏡器件4無加載圖像且不加載實驗樣品16時，光束被反射經過前縮束模塊透鏡6和后縮束模塊透鏡7，照射到二向色鏡8的側面被反射，反射光束經過前掃描振鏡9、前光束準直透鏡10、后光束準直透鏡11、后掃描振鏡12、前掃描模塊透鏡13和后掃描模塊透鏡14后進入顯微物鏡15，并在焦平面處形成理想的聚焦光斑，記聚焦光斑中心在焦平面的位置為of。

(2)加載實驗樣品16，數字微鏡器件4無加載圖像時，激光器1發出的光束依次經過光纖2和準直透鏡3后，照射到數字微鏡器件4上，光束被反射經過前縮束模塊透鏡6和后縮束模塊透鏡7，照射到二向色鏡8的側面被反射，反射光束經過前掃描振鏡9、前光束準直透鏡10、后光束準直透鏡11、后掃描振鏡12、前掃描模塊透鏡13和后掃描模塊透鏡14后進入顯微物鏡15，并在實驗樣品16內焦平面處形成畸變的散射聚焦光斑，并激發出熒光。

(3)熒光從實驗樣品16內發射進入顯微物鏡15，然后依次經過后掃描模塊透鏡14、前掃描模塊透鏡13、后掃描振鏡12、后光束準直透鏡11、前光束準直透鏡10、前掃描振鏡9、二向色鏡8、光學濾波器17、聚焦透鏡18和光纖19、聚焦透鏡20后進入光電倍增管21進行光強探測，通過掃描得到無數字微鏡器件篩選時的散射聚焦光斑圖像，如圖2所示。記此時of對應位置的光強值。在本具體實施案例中由于光強最強點偏移，of對應位置的光強值為43.77。

(4)在本具體實施案例中將數字微鏡器件的微鏡像素元以32×32方式均勻分為1024個區域，從而將準直擴束后的入射光束分為對應的1024個光束單元。將1024個分區等分為無共同分區的兩大部分，根據奈奎斯特采樣定律選擇合適的調制頻率，使得每個部分中的每個分區都有不同的強度調制頻率。保持第二部分的分區不變，第一部分內的各分區內的微鏡同時以對應的不同頻率進行振動，使得光束以對應的頻率在后續光路與旁側光路的光擋之間來回偏轉，從而對不同分區的光束進行不同頻率的強度調制。由光電倍增管實時記錄在of處的熒光光強值。在本具體實施案例中，1024個分區等分的情況如圖3與圖4所示，所采用的最大調制頻率為204.8hz、頻率間隔為0.2hz；光電倍增管探測到的強度調制后的部分熒光光強值如圖5所示。

(5)將步驟(4)所得光強值做傅里葉變換，傅里葉變換后繪制的頻率-幅值圖如圖6所示，并在各分區對應的頻率上求得對應的補償相位。保留相位值小于等于π的分區并去除相位值大于π的分區，得到篩選分區圖像。從熒光光強值中計算得到的部分分區補償相位值如圖7所示；第一部分分區所需進行相位補償的分區分布圖如圖8所示；第二部分分區所需進行相位補償的分區分布圖如圖9所示。

(6)將篩選分區圖像加載到到數字微鏡器件4上，入射光束經光纖2和準直透鏡3后，照射到數字微鏡器件4上，被去除的分區對應的光束被反射至旁側光路的光擋5上，從而不參與聚焦，被保留的分區對應的光束被反射經過前縮束模塊透鏡6和后縮束模塊透鏡7，照射到二向色鏡8的側面被反射，反射光束經過前掃描振鏡9、前光束準直透鏡10、后光束準直透鏡11、后掃描振鏡12、前掃描模塊透鏡13和后掃描模塊透鏡14后進入顯微物鏡15，并在實驗樣品16內焦平面處形成最終的光束聚焦增強光斑，并激發更強的熒光。在本具體實施案例中數字微鏡器件篩選后需要補償的分區分布圖如圖10所示。

(7)經過光束聚焦增強后激發的熒光從實驗樣品16內發射進入顯微物鏡15，然后依次經過后掃描模塊透鏡14、前掃描模塊透鏡13、后掃描振鏡12、后光束準直透鏡11、前光束準直透鏡10、前掃描振鏡9、二向色鏡8、光學濾波器17、聚焦透鏡18、光纖19和聚焦透鏡20后進入光電倍增管21進行光強探測，通過掃描得到數字微鏡器件4加載篩選分區進行光束聚焦增強后的聚焦光斑圖像，如圖11所示，在本具體實施案例中該圖像of位置對應的光強值為286.1。

傳統的相干光自適應技術采用空間光調制器進行相位的探測。假設將空間光調制器分成32×32個分區，每個分區各自以一定的相位間隔同時改變對應光束的相位，經過光強探測后計算得到需要進行校正的相位值。假設空間光調制器工作時的圖像加載速率上限為60hz，加載相位間隔所消耗的時間受空間光調制器的速率限制，采樣點數為2048，因此完成一次光學聚焦相位探測所需要的時間為：

而本發明所使用的數字微鏡器件的圖像刷新率上限為22727hz，同樣將其分為32×32個分區，分區之間的調制頻率間隔為22727/1024hz≈22.19hz，取22hz則其完成一次光束聚焦增強分區的篩選時間為：

由于采用空間光調制器進行相干光學自適應技術的處理時間受限于空間光調制器的圖像刷新率。而本發明利用數字微鏡器件快速的圖像刷新率，極大地減少了光束聚焦增強所需要的處理時間，顯著提升了光束聚焦增強的處理速度。

由上述實施例可見，本發明基于數字微鏡器件的快速精準光學聚焦增強方法與系統簡單、便捷，能夠在簡單、快速的相干光自適應補償相位探測之后，將對光束聚焦中心干涉相消的光束分區進行剔除，保留對中心光強有貢獻的干涉相長的光束分區，從而將目標光束聚焦點的光強提升約553.6％。相比于利用空間光調制器進行逐次相位校正以及基于相干光自適應技術的空間光調制器相位補償，本發明能夠在提升聚焦光斑中心光強的同時縮短校正時間，為光遺傳學光刺激與實時成像提供了更低成本更便捷的實驗技術，提升了實驗效率。