STED超分辨顯微技術中損耗光斑的高質量重建方法與流程

本發明屬于光學超分辨顯微領域，特別涉及一種STED超分辨顯微技術中損耗光斑的高質量光學重建方法，以實現厚生物組織樣本或者其他散射介質條件下的超分辨顯微成像。
背景技術：
：超分辨顯微技術的誕生從原理上打破了原有光學遠場衍射極限對光學系統極限分辨率的限制，能夠觀察到分子尺度的細節，實現了分辨率達幾十納米的細胞成像。受激發射損耗顯微成像技術STED由StefanHell教授發明的，一種通過焦點調制從而獲得超分辨成像的方法，因而獲得2014年諾貝爾化學獎。根據受激輻射淬滅消光能力、損耗光光強存在著非線性關系，利用受激福射選擇性消耗邊緣區域內的激發態焚光分子，抑制其發光，從而壓縮的大小。光學顯微成像技術為生物醫學帶來了里程碑式的進步。然而生物組織不是成像的理想結構，因為它們光學性質的不均勻性嚴重地影響了成像質量。當光線經過光學系統和樣本時，理想的平面波前或球面波前將會引入扭曲的畸變，理想路徑的任何偏離都會導致光學畸變。光在傳播過程中發生的畸變，會降低信噪比與分辨率，使成像質量降低。而且隨著成像深度的增加，分辨率迅速惡化。這些問題一直困擾著光學工作者。深層的高分辨率成像技術已經成為21世紀發展的最迅速和熱門的科學技術。自適應光學技術最早被用于天體物理。當用望遠鏡觀察遙遠的天體時，大氣湍流會造成光學畸變，影響成像質量。應用自適應光學技術的望遠鏡可以很好地解決這個問題。利用波前傳感器可以實時對畸變的波前進行探測，然后通過變形鏡、空間光調制器等光學校正系統對畸變進行補償。最終能夠很好地對天體進行觀測。現在自適應光學技術逐步應用于超分辨顯微成像，以校正生物樣品深層成像時的光學畸變。受到像差和散射的影響，傳統STED顯微技術中，如何對樣品內部深層成像時保持超分辨已經成為一個難題。利用自適應光學技術來糾正較厚生物組織樣品成像時出現的光學畸變現象可以極大改善組織成像質量。因此研究將自適應方法運用于受激輻射淬滅(STED)顯微技術中損耗光斑由散射帶來的形狀變化及位置變化，并在此基礎上驗證該技術的可行性與可靠性就顯得尤為重要。技術實現要素：為了解決
背景技術：
中存在的問題，本發明提供了一種STED超分辨顯微技術中損耗光斑的高質量重建方法，以實現厚生物組織樣本或者散射介質條件下的超分辨光學顯微成像。本發明應用于有一定尺寸大小的損耗空心光斑，在大深度條件下得到完整而良好的損耗光斑，可用于在活體、大深度條件下實現對損耗光斑由散射帶來的形狀變化及位置變化的校正。本發明采用的技術方案包括以下步驟：1)不加載樣品時，光束先經過均一相位的空間光調制器透射，再經過2π渦旋相位板透射，然后經過物鏡聚焦，在焦平面位置得到理想損耗光斑；2)加載樣品時，光束先經過均一相位的空間光調制器透射，再經過2π渦旋相位板透射，然后經過物鏡聚焦，在位于散射介質內部的焦平面位置處得到畸變損耗光斑；3)光束經過加載相位的空間光調制器透射，再經過2π渦旋相位板透射，然后經過物鏡聚焦，在位于散射介質內部的焦平面位置處得到需校正損耗光斑，將需校正損耗光斑與步驟1)的理想損耗光斑進行互相關計算和處理；4)重復步驟3)將光束經過不同加載相位的空間光調制器進行多次處理，完成校正重建。所述步驟4)具體是指：4.1)將空間光調制器的像素點以n×n方式均勻分區，如12×12，每個分區包含i×i個像素點。光束經過針對分區相位調制后的空間光調制器透射，再經過2π渦旋相位板透射，然后經過物鏡聚焦，在位于散射介質內部的焦平面位置處得到需校正損耗光斑；4.2)將得到的需校正損耗光斑與理想損耗光斑進行互相關計算，得到m個相關系數，如m＝100；4.3)記錄相關系數最大時分區的相位值，并以該相位值固定賦予到所對應分區上；4.4)空間光調制器從第一個分區開始到最后一個分區重復上述步驟，每個分區依次進行相位變化，完成多次，獲得最終校正后的光斑，實現高質量重建。所述步驟4.1)中空間光調制器是采用以下方式調制：將一分區內所有像素點從2π/m到2π進行相位值的依次間隔變化，變化間隔為2π/m，其他分區的相位保持不變，每個相位值下進行一次，從而獲得一組需校正損耗光斑。所述的散射介質采用活體生物組織、離體生物組織、毛玻璃和帶非熒光小球的瓊脂。本發明的工作原理如下：本發明對STED超分辨顯微技術中損耗光斑進行高質量重建，通過理想損耗光斑與需校正損耗光斑進行互相關計算，利用兩幅圖互相關系數最大作為調制信號，調整空間光調制器相位，使得需校正損耗光斑與理想損耗光斑擬合。并進行多次迭代優化，達到損耗光斑的最佳高質量重建效果。本發明的有益效果是：本發明能重建有一定尺寸大小的損耗空心光斑，能夠在大深度下得到完整而良好的損耗光斑，擴展了受激輻射淬滅(STED)顯微技術的應用范圍，提高系統的分辨率與信噪比，優化成像質量。本發明高質量的成像指的是經過校正的空心光斑與理想空心光斑的互相關系數和畸變空心光斑與理想空心光斑的互相關系數相比得到了提升，從而提高了系統的分辨率與信噪比，優化了成像質量。附圖說明圖1為本發明方法的示意圖；圖2為理想損耗光斑圖；圖3為經過散射介質的畸變損耗光斑圖；圖4為空間光調制器n×n均勻分區方式示意圖；圖5為經過第一次校正的損耗光斑圖；圖6為經過第二次校正的損耗光斑圖；圖7為經過第三次校正的損耗光斑圖；表1為n＝12，m＝100情況下第一次校正第66個分區加載不同相位時得到的互相關系數；表2為未進行矯正與第1.2.3次校正完成后的空心光斑與理想空心光斑的互相關系數。圖中：空間光調制器1、2π渦旋相位板2、物鏡3、散射介質4和物鏡焦平面5。具體實施方式下面結合附圖來詳細說明本發明。本發明的實施例如下：如圖1所示，本發明實施采用的光路系統包括空間光調制器1、2π渦旋相位板2、物鏡3、散射介質4和物鏡焦平面5，空間光調制器1、2π渦旋相位板2和物鏡3同軸依次布置，物鏡焦平面5位于散射介質4內部，散射介質為鼠腦。具體步驟如下：(1)不加載樣品時，光束先經過均一相位的空間光調制器1透射，再經過2π渦旋相位板2透射，然后經過物鏡3聚焦，在焦平面位置5得到理想損耗光斑，如圖2所示；(2)加載樣品時，光束先經過均一相位的空間光調制器1透射，再經過2π渦旋相位板2透射，然后經過物鏡3聚焦，在位于散射介質鼠腦4內部的焦平面位置5處得到畸變損耗光斑，如圖3所示；(3)將空間光調制器1進行分區，如圖4所示，第一個分區的變化范圍為2π/m～2π，變化間隔為2π/m，其他分區相位保持不變；光束先經過加載相位的空間光調制器1透射，再經過2π渦旋相位板2透射，然后經過物鏡3聚焦，在位于散射介質4內部的焦平面位置5處得到需校正損耗光斑；(4)將理想損耗光斑與需校正損耗光斑進行互相關計算，得到m個相關系數；(5)記錄相關系數最大時第一個分區的相位值，并將該相位值固定；(6)第一個分區固定相位值后，剩余每個分區依次按照步驟(3)的方式進行相位變化，每次處理時其他固定的相位值保持不變，然后重復步驟(4)和(5)完成一次校正；n＝12，m＝100情況下第一次校正第66個分區加載不同相位時得到的互相關系數如表1所示；第一次校正結果如圖5所示，圖中可見損耗光斑開始重建；表1實施例第一次校正第66個分區加載不同相位時得到的互相關系數相位值互相關系數相位值互相關系數相位值互相關系數1*2π/1000.762041*2π/1000.761881*2π/1000.76142*2π/1000.762042*2π/1000.761882*2π/1000.76143*2π/1000.762043*2π/1000.761883*2π/1000.76144*2π/1000.762044*2π/1000.761884*2π/1000.76145*2π/1000.762045*2π/1000.761885*2π/1000.76146*2π/1000.762046*2π/1000.761886*2π/1000.76137*2π/1000.762047*2π/1000.761887*2π/1000.76138*2π/1000.762048*2π/1000.761888*2π/1000.76139*2π/1000.761949*2π/1000.761889*2π/1000.761310*2π/1000.761950*2π/1000.761890*2π/1000.761411*2π/1000.761951*2π/1000.761891*2π/1000.761412*2π/1000.761952*2π/1000.761892*2π/1000.761513*2π/1000.761953*2π/1000.761893*2π/1000.761714*2π/1000.761954*2π/1000.761894*2π/1000.761915*2π/1000.761955*2π/1000.761895*2π/1000.762416*2π/1000.761956*2π/1000.761896*2π/1000.763317*2π/1000.761957*2π/1000.761797*2π/1000.765018*2π/1000.761958*2π/1000.761798*2π/1000.768419*2π/1000.761959*2π/1000.761799*2π/1000.775320*2π/1000.761960*2π/1000.76172π0.762221*2π/1000.761961*2π/1000.761722*2π/1000.761962*2π/1000.761723*2π/1000.761963*2π/1000.761724*2π/1000.761964*2π/1000.761725*2π/1000.761965*2π/1000.761726*2π/1000.761966*2π/1000.761727*2π/1000.761967*2π/1000.761628*2π/1000.761968*2π/1000.761629*2π/1000.761969*2π/1000.761630*2π/1000.761970*2π/1000.761631*2π/1000.761971*2π/1000.761632*2π/1000.761972*2π/1000.761633*2π/1000.761973*2π/1000.761634*2π/1000.761974*2π/1000.761635*2π/1000.761975*2π/1000.761536*2π/1000.761976*2π/1000.761537*2π/1000.761977*2π/1000.761538*2π/1000.761978*2π/1000.761539*2π/1000.761979*2π/1000.761540*2π/1000.761880*2π/1000.7615(8)重復步驟(3)-(7)，進行第二次校正，結果如圖6所示，圖中可見損耗光斑形狀位置大致復原，呈圓環狀；再重復步驟(3)-(7)，進行第三次校正，結果如圖7所示，圖中可見損耗光斑進一步復原，中心圓環形狀位置進一步優化。隨著校正次數的增加，需校正損耗光斑與理想損耗光斑的擬合程度越來越高，使系統達到最佳高質量的重建，具體互相關系數可見表2。表2實施例空心光斑與理想空心光斑的互相關系數互相關系數畸變空心光斑與理想空心光斑0.6277第一次校正空心光斑與理想空心光斑0.8661第二次校正空心光斑與理想空心光斑0.9324第三次校正空心光斑與理想空心光斑0.9482由此可見，本發明能重建有一定尺寸大小的損耗空心光斑，能夠在大深度下得到完整而良好的損耗光斑，擴展了受激輻射淬滅(STED)顯微技術的應用范圍，提高系統的分辨率與信噪比，具有高質量的成像。當前第1頁1 2 3