具有在至少兩個波長范圍之間的區分功能的高分辨率掃描顯微術的制作方法

文檔序號：11160582閱讀：947來源：國知局

本發明涉及一種用于對試樣進行高分辨率掃描顯微成像的方法，其中，試樣利用照明輻射以如下方式受激發射熒光輻射，使得照明輻射集束到試樣中或試樣上的一點上，以形成受衍射限制的光斑，所述點受衍射限制地成像到對具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，其中，平面檢測器具有位置分辨能力，其對衍射圖的衍射結構加以分辨，所述點相對于試樣以小于光斑直徑一半的步進幅度推移到不同的掃描位置中，對平面檢測器進行讀取，基于平面掃描器的數據以及基于對應于上述數據的掃描位置產生試樣的圖像，所述圖像具有超出成像的分辨率極限地升高的分辨率。

本發明還涉及一種用于對試樣進行高分辨率掃描顯微成像的顯微鏡，具有：用于容納試樣的試樣腔室，試樣能夠受激發射熒光輻射；具有處在試樣腔室中的焦平面和分辨率極限的光學器件；照明裝置，照明裝置具有用于輸送照明輻射的輸入端并且照明裝置借助于光學器件以如下方式以照明輻射照射試樣腔室，使得光學器件將照明輻射在焦平面內的一個點上集束成受衍射限制的光斑；成像裝置，用于通過光學器件、受衍射限制地將焦平面內的所述點成像到具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，具有位置分辨能力的平面檢測器處在與焦平面共軛的檢測器平面中，其中，平面檢測器具有對衍射圖的衍射結構進行解析的位置分辨率；用于將所述點以小于光斑直徑一半的步進幅度推移到不同的掃描位置中的掃描裝置；用于讀取平面檢測器的評估裝置，用以基于平面掃描器的數據以及基于對應上述數據的掃描位置來評估衍射圖的衍射結構以及用以產生試樣的圖像，所述圖像具有超出分辨率極限地升高的分辨率。

背景技術：

用于研究生物樣品的光顯微術的傳統的應用領域是照明顯微術。在此情況下，一定的染料(所謂的磷光劑或熒光劑)被用于特定標記試樣，例如細胞部分。試樣利用代表激勵輻射的照明輻射照射，由此受激的發光輻射利用適當的檢測器檢測得到。通過上述過程，可以在顯微鏡中顯示各個不同地染色的細胞部分。當然也可以對樣品的多個部分同時利用不同的、特定地附著到樣品的不同結構上的染料來染色。這種方法被稱為多重發光。也可以設置本身無需添加染料就能發光的試樣。

在這里，發光如通常所見那樣，被理解為磷光和熒光的上位概念，也就是檢測兩個過程。只要在這里提起熒光，這是以部分代表整體并且被理解為不受限制。

為了檢測試樣，同樣已知的是，應用激光掃描顯微鏡(也簡稱LSM)，其借助于共焦檢測裝置(也被說成共焦LSM)或非線性的試樣相互作用(所謂的多光子顯微鏡)僅對處在物鏡的焦平面中的相應平面成像。獲取光學切片，并且在試樣的不同深度中對多個光學切片進行記錄，實現了：生成三維圖像，三維圖像由不同光學切片組合而成。由此，激光掃描顯微術適用于研究厚的樣品。當然也可以應用發光顯微術與激光掃描顯微術的組合方案，其中，借助于LSM在不同的深度平面中使發光試樣成像。

原則上，光學顯微鏡的光學分辨率(也就是LSM的分辨率)基于物理定律而受衍射限制。在這里，術語“高分辨率”被用于針對衍射極限的分辨率。

US5043570介紹了一種通過“過采樣(oversampling)”提供分辨率的試驗。這種方案不能明顯改善顯微鏡衍射極限以下的分辨率。

借助于非線性的去布局()，能夠將分辨率相對于受衍射限制的共焦LSM提高至10倍。這種方法例如在US5866911中加以介紹。針對去布局，已知不同的方案，例如在DE4416558C2、US6633432或者DE10325460A1中加以介紹。

另一高分辨率的顯微成像方法在US5867604中提到，其中，物體被以周期性結構掃描。類似的用于提高分辨率的方法在EP1157297B1中提到。結構化的照明利用非線性的過程，例如熒光飽和。這種方案需要用于產生圖像的重構算法并且將用于一個圖像的多幅照片進行評估。

在寬場中實現高分辨率的方法由WO2006127692和DE102006021317已知。以PALM簡稱的方法(光激活光學顯微術(Photo Activated LightMicroscopy))使用標記物質，標記物質能夠借助于光學激活信號激活。僅在激活的狀態下，標記物質能夠利用激發輻射受激發出一定的熒光輻射。激活以如下方式執行，至少一定子集的被激活的標記分子與相鄰的被激活的分子以如下方式間隔，這些標記分子以顯微術的光學分辨率測量的方式被區分開或者可以事后區分。在吸收發光輻射之后，針對分離的分子能夠獲得其以受分辨率限制為條件的輻射分布的中心，并且由此以相比于原來實現的光學成像更高的精度計算確定分子的位置。為了對整個試樣成像，通過引入激發輻射將子集的標記分子加以區分、后續的激發和熒光輻射成像以如下時長重復，直至使盡可能所有標記分子一次性在一個子集中獲得并且被分離。

其他高分辨率的方法在Hell的“Far-Field Optical Nanoscopy(遠場光學顯微術)”Science 316，1153-1158，2007中有所介紹。

這種方法和顯微鏡由EP2317362A1已知。涉及這種類型的文獻在其中圖5所示而且介紹的實施方式中，將對試樣受衍射限制的照明與平面檢測器相組合，其中，掃描裝置以如下方式設計，利用光斑照明的點的衍射圖以平面檢測器為基礎。這種結構被稱為所謂的“共聚焦(de-scanned)”檢測結構。這種檢測器結構通常以如下方式實現，在照明裝置和成像裝置與試樣之間布置有掃描裝置，掃描裝置使光路轉向。這樣，這種掃描裝置作用于照明光斑，也作用于以照明光斑照亮的點的受衍射限制的成像，使得在成像裝置中，在掃描裝置之后，光路固定不動。針對這種掃描裝置的可替換方案是能夠運動的試樣臺的應用，試樣臺移動試樣。這樣，衍射圖像靜止于平面檢測裝置上。在EP2317362A1的方案中，平面檢測器設有如下的位置分辨率，其與成像比例相關地實現衍射圖的過采樣，并且允許：對衍射圖的衍射結構進行采樣或者說解析。

EP2317362A1設置如下的實施方式，其中，可以進行顏色分析。為此，設置有多個檢測器，所述檢測器處在相應的光譜波道中，所述光譜波道由二色性分色器形成。這種方案對于激光掃描顯微術長期以來已經已知。但這種方案具有缺陷，針對每個色彩波道需要設置具有相應檢測器的相應的分色器。在常規的激光掃描顯微術(其使用了在共焦孔板(所謂的小孔)后方的不具有位置分辨能力的檢測器)中，這種要求基本上沒有問題，在應用根據EP2317362A1的過采樣的平面檢測器中，則明顯產生耗費，這時，這種平面檢測器昂貴。此外，按照EP2317362A1的過采樣原理，多個平面檢測器必須彼此在亞像素水平上精確地校準，因為否則在各個色彩波道所產生的圖像之間顏色偏差，這種顏色偏差的原因在于，對于高分辨率的圖像，平面檢測器的數據被移動到以小于光斑直徑的步進量移動的掃描位置中。僅當平面檢測器在所有色彩波道中相對于光軸以亞像素水平的精度調校時，各個色彩波道的圖像才彼此匹配。

技術實現要素：

因此，本發明的目的在于，以如下方式改進開頭所述類型的方法或顯微鏡，使得能夠獲得顏色信息，同時針對多個色彩波道的調校耗費被降低或者甚至省去。

按照本發明，所述目的利用一種用于對試樣進行高分辨率掃描顯微成像的方法來實現，其中，試樣利用照明輻射以如下方式受激發射熒光輻射，使得照明輻射集束到試樣中或上的一點上，以形成受衍射限制的光斑，所述點受衍射限制地成像到對具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，其中，平面檢測器具有其對衍射圖的衍射結構加以分辨的位置分辨能力，所述點相對于試樣以小于光斑直徑一半的步進幅度推移到不同的掃描位置中，對平面檢測器進行讀取，基于平面掃描器的數據以及基于對應于上述數據的掃描位置產生試樣的圖像，所述圖像具有超出成像的分辨率極限的分辨率，為了對試樣的熒光輻射中的至少兩個預先確定的波長范圍加以區分，借助于光譜選擇性的元件在平面檢測器上針對至少兩個預先確定的波長范圍，產生相應數量的衍射艾里斑，其沿側向彼此錯開，使得衍射圖由彼此錯開的衍射艾里斑構成，衍射艾里斑完全處在平面檢測器上，在產生試樣圖像時，對衍射艾里斑加以評估。

所述目的還利用一種用于高分辨率掃描顯微成像的顯微鏡來實現，其具有：用于容納試樣的試樣腔室，試樣能夠受激發射熒光輻射；具有處在試樣腔室中的焦平面和分辨率極限的光學器件；照明裝置，照明裝置具有用于輸送照明輻射的輸入端并且照明裝置借助于光學器件以如下方式以照明輻射照射試樣腔室，使得光學器件將照明輻射在焦平面內的一個點上集束成受衍射限制的光斑；成像裝置，用于通過光學器件、受衍射限制地將焦平面內的所述點成像到具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，具有位置分辨能力的平面檢測器處在與焦平面共軛的檢測器平面中，其中，平面檢測器具有對衍射圖的衍射結構進行分辨的位置分辨能力或者說進行解析的位置分辨率；用于將所述點以小于光斑直徑一半的步進幅度推移到不同的掃描位置中的掃描裝置；用于讀取平面檢測器的評估裝置，用以基于平面掃描器的數據以及基于對應上述數據的掃描位置來評估衍射圖的衍射結構以及用以產生試樣的圖像，所述圖像具有超出分辨率極限的分辨率，顯微鏡為了區分試樣的熒光輻射中的至少兩個預先確定的波長范圍而具有光譜選擇性的元件，所述光譜選擇性的元件在平面檢測器上針對至少兩個預先確定的波長范圍產生相應數量的衍射艾里斑，其沿側向彼此錯開，使得衍射圖由彼此錯開的衍射艾里斑構成，平面檢測器和光譜選擇性的元件以如下方式設計，使得衍射艾里斑完全處在平面檢測器上，并且評估單元在產生試樣圖像時，對衍射艾里斑加以評估。

本發明僅利用一個平面檢測器同時實現了分辨率提升以及光譜圖像信息，方式為：衍射圖像在檢測器上被分為至少兩個彼此相互移位的衍射艾里斑。為此，使用光譜選擇性的元件。每個衍射艾里斑對應一個波長范圍(也稱為色彩波道)。

由此，所述方法和所述顯微鏡實現了：區分至少兩個波長范圍。試樣的圖像以LSM常見的方式通過以所述點位對樣品加以采樣拍攝多幅分圖，這些分圖分別對應其他采樣點、也就是其他采樣位置。

衍射艾里斑當光束在圓形遮光邊上發生衍射時產生。衍射艾里斑顯現出中心，衍射艾里斑被輻射強度逐漸降低的環包圍。根據幾何光學器件的定律完美的顯微鏡本身(也就是無成像差錯)可以將一個點不精確地成像到一點上，而是通過光在孔徑上的衍射，僅成像為不明晰的光斑。這稱為受衍射限制的成像。相同的情況對于點的受衍射限制的照明適用。兩個點可以在傳統的輻射光學器件中根據所謂的瑞利判據來區分，這時，其在衍射圖中的成像最大值至少圍繞衍射艾里斑的半徑r彼此分離而置。光斑的形狀互反地依賴于孔徑的形狀，特別是其尺寸反過來與孔徑的尺寸成正比。衍射艾里斑的尺寸由第一類型貝塞爾函數的第一零位置得出，其零位置大致處于r＝0.6098處。衍射艾里斑(也就是中央衍射斑)根據英國天文學家喬治·比德爾·艾里(George Biddell Airy)的名字也稱為艾里斑。在掃描顯微術中，在照明時以及在成像時，由對光學器件的圓形輪廓所得的孔徑是圓形的。因為衍射艾里斑的尺寸還依賴于波長，所以艾里斑的尺寸在用來激發的、受衍射限制的照明中小于在發生斯托克斯移位的、也就是波長較長的熒光發光的情況中的尺寸。

術語“受衍射限制”應當在這里不限于根據阿貝理論的衍射極限，而是也可以涉及如下情況，其中，基于真實的缺陷或限制，理論上的最大值推薦約為20％。這樣，分圖也具有如下結構，其在這里稱為衍射結構。衍射結構被過采樣。

為了能夠利用盡可能成本低廉的檢測器來工作，在本發明的一種實施方式中足夠的是，衍射艾里斑彼此相疊，但是并沒有完全重疊。在此，重疊區域應當優選以如下方式設置，每個衍射艾里斑的中心處在其他衍射艾里斑之外。也就是說，對于兩個衍射艾里斑而言，其中心在平面檢測器上處于不被其他衍射艾里斑遮蓋的區域中。對于多個衍射艾里斑，這一點同樣適用。這種要求對于最多四個衍射艾里斑的情況而言，能夠很容易滿足。

檢測器尺寸可以保持得盡可能小，這時，光譜選擇性的元件在色譜上以如下方式設計，彼此相對錯開的衍射艾里斑具有相同尺寸。這如上所述那樣，基于衍射艾里斑的與波長相關的尺寸僅以如下方式實現，光譜選擇性的元件執行相應的尺寸修正，尺寸修正將較長波長的波長范圍的衍射艾里斑相對于較短波長的衍射艾里斑縮小。當這種色譜修正不成功時，對應不同波長范圍的衍射艾里斑大小不同，這通過衍射艾里斑彼此并排沿側向移位優選得到補償，以便將衍射艾里斑的中心分開，也就是所述中心不處在其他衍射艾里斑內部。

對應波長范圍的衍射艾里斑的產生可以按照不同方式實現。在第一變型中，光譜選擇性的元件或光譜分離在平面檢測器前面并且光路的照明輻射所經過的部分中進行。這樣，成像輻射通過直至光譜選擇性的元件的光路，在光譜選擇性的元件上，衍射圖被分成各個波長范圍衍射艾里斑。在第二變型中，光譜分離在照明或照明裝置中進行，方式為：成像不涉及光譜分離。按照這種方式，試樣中的光斑已經按照多個沿側向彼此錯開的衍射艾里斑的形式產生。

在第一個提到的變型中，光譜分離僅影響到試樣的熒光反饋。在第二變型中，僅影響到試樣的熒光激發。由此，第一變型區分出以不同顏色發熒光的試樣的色彩波道。相反，第二變型分辨出試樣的在不同波長范圍中能夠被激發的組成部分。兩個變型意味著：光譜選擇性的元件處在一部分僅被成像裝置或照明裝置照射的光路中，而不是由二者一起照射。與此不同地，也可以考慮布置在光路的共同部分中的方案。

本發明的核心在于，波長范圍在空間上就衍射艾里斑在平面檢測器上的位置方面得到區分。因為在平面檢測器上存在靜止圖像(所謂的解析結構)，所以與相應的波長范圍(也稱為色彩波道)相對應的衍射艾里斑的位置是已知的，當產生圖像時，可能將同時拍攝的波長范圍混淆。按照這種方式，對多個色彩波道的同時拍攝利用唯一的平面檢測器就能實現。

因為在根據EP2317362A1的重構方法中，基于以小于光斑尺寸的步進幅度進行掃描移位，針對試樣中的各個點存在多次測量，所以獲得了在需要列出而且解答的方程組中獲得超定的解，使得不僅針對各個點的位置表達和強度能夠以高分辨率給出，而且也能夠對波長范圍(也就是顏色)加以表達。

在本發明的特別有利的改進方案中，彼此相對移位的衍射艾里斑的位置在所對應的波長范圍方面能夠通過可調設計的光譜選擇性的元件來匹配。按照這種方式，色彩波道能夠以如下方式調整，使得所希望的波長范圍得以區分。

按照本發明的方案也可以按照并行的形式針對多個光斑同時執行，這正如針對激光掃描顯微術已知那樣。這樣，試樣上的多個點位被掃描采樣，并且多個點位的分圖彼此并排靜止處在檢測平面中。后面的說明示例性集中在對單個點狀光斑的采樣。但這不應理解為是限制，所闡釋的特征和原則在意義上也適用于并行采樣多個點狀光斑，正如針對線狀光斑所用那樣。后面的方案當然僅橫向于線延伸受到衍射限制，使得說明的相關特征僅沿一個方向(橫向于線延伸)地適用。

試樣的所希望的區域的成像如在常見的LSM中那樣以掃描的方式實現。因為照明和成像或相應的裝置具有共同的光學掃描裝置，所述光學掃描裝置將光斑導引通過試樣，同時再次與檢測器相關地解析與光斑重合的、在其上對試樣成像的點，所以可以將對焦光學器件設置在照明和成像裝置的共同部分中。對焦光學器件實現了：將衍射圖與平面檢測器的尺寸相匹配，并且附加地將能夠提供的照明輻射在無邊緣損耗的情況下完全耦合輸入到能夠通過選擇物鏡來改變的物鏡光瞳中。

分圖的衍射結構的分辨率附加地實現了：獲知光斑的運動方向，沿著所述方向在采樣試樣期間移動。運動方向雖然原則上由掃描裝置的結構(例如掃描鏡或能夠運動的試樣臺)已知，但是在這里獲得以機械為條件的殘余不精確性。這可以通過借助于互相關對檢測器陣列的各個像素信號加以評估來消除。在此，利用的是，被照明的點與彼此并排而置的圖像像素相關地在試樣中基于受衍射限制的成像按照一定程度相疊，但其中心不挨著設置。當這種圖像像素的信號經過互相關時，能夠降低或完全消除由于掃描機構的不可避免的公差而存在的不精確度。

只要在這里介紹一種方法，控制裝置就在顯微鏡工作時實現方法步驟。

不言而喻的是，前面提到的而且后面還有闡釋的特征不僅用在所給出的組合中，而且也能夠以其他組合或者單獨使用，而不離開本發明的范圍。

附圖說明

下面，例如借助于也公開了對于本發明關鍵的特征的附圖詳細闡釋本發明。其中：

圖1示出用于高分辨率顯微成像的激光掃描顯微鏡的示意圖；

圖2示出在圖1的顯微鏡中所使用的平面檢測器的放大圖；

圖3至圖6示出衍射圖的圖示，衍射圖在圖1的顯微鏡工作時以不同的實施方式出現在平面檢測器上，以及

圖7示出照明衍射圖的圖示，其在照明試樣時能夠以圖1的顯微鏡的實施方式出現。

具體實施方式

圖1示意示出激光掃描顯微鏡1，激光掃描顯微鏡被設計用于對試樣2進行顯微成像。激光掃描顯微鏡(在下面簡稱為LSM)由控制裝置C控制，并且包括照明光路3以及成像光路4。照明光路照亮試驗2中的一個點位，成像光路4受衍射限制地對所述點位進行成像，用以檢測。照明光路3和成像光路4共用一個光學器件。

試樣2的照明在LSM1中借助于所提供的激光光束5來實現，激光光束借助于未進一步在功能上需要的轉向鏡6和透鏡7耦合輸入到鏡8上。鏡8負責將激光光束5以反射角透射到耦合輸入元件上，例如發射濾片9上。為了概覽圖示表達，針對激光光束5僅繪出其主軸。

當在發射濾片9上發射之后，激光光束5借助于掃描裝置10雙軸偏轉，并且借助于透鏡11和12通過物鏡13作為受衍射限制的光斑14聚焦到試樣2中的焦平面29中。在此，光斑在圖1的圖示中呈點狀，但也可以是線狀的光斑。當在成像裝置中又存在靜止的光束之后，在光斑14的位置(例如點)上激發出的熒光輻射從焦平面29經物鏡13、透鏡11和12再次導引至掃描裝置10。靜止的光束穿過發射濾片9投射，反射濾片在這里附加地具有如下功能，使光斑14中的熒光輻射在其波長方面得到選擇，激光光束5的例如能夠用作激發輻射的照明輻射被阻擋。透鏡16負責用于總體上將光斑14的位置成像到受衍射限制的衍射圖17中，所述衍射圖處在檢測平面18中。檢測平面18是焦平面29的共軛平面，在其中存在試樣2中的光斑14。

光斑14的衍射圖17在檢測平面18中由平面檢測器19拍攝，平面檢測器的示例實施方案在下面借助于圖2詳細闡釋。在這里重要的是，平面檢測器19在空間上對檢測平面18中的點位14的受衍射限制的圖像17進行解析，也就是實現過采樣()。

控制裝置C控制LSM1的所有部件，特別是掃描裝置10和平面檢測器19。控制裝置針對不同的掃描位置采集各個圖像17的數據，分析其衍射結構并且產生試樣2的高分辨率的總圖。

圖1的LSM針對在試樣上采樣的唯一的光斑14示例示出。但也可以用于根據線形光斑進行采樣，線形光斑例如垂直于圖1的圖頁平面延伸。同樣可行的是，圖1的LSM1以如下方式實施，多個彼此并排的點狀光斑在試樣中得到采樣。其相應的衍射圖17則同樣彼此并排地處在檢測平面18中。平面檢測器19則相應設計用于對檢測平面18中彼此并排的衍射圖17加以檢測。

平面檢測器19放大地在圖2中示出。平面檢測器由光導纖維束20構成，光導纖維束對檢測器陣列24饋給。光導纖維束20由單光導纖維21構成。光導纖維21的端部形成光導纖維束輸入端22，其處在檢測平面18中。光導纖維21的各個端部由此代表由其拍攝光斑14的衍射圖17的像素。因為光斑14在圖1的實施方式中例如為點狀點位，衍射圖17是艾里斑，艾里斑的伸展處在圖1和圖2中圖示出的檢測平面18的圓形內部。需要指出的是，圖1在此方面獲得簡化。光導顯微術輸入端22的伸展如此大，使得由此遮蓋衍射圖的伸展。光導顯微術20中的各個光導纖維21在其輸出端上被設置為不同于光導纖維束輸入端22上的幾何布置方案，也就是呈縱向延伸的插頭23的形式，光導纖維21的輸出端方面的端部彼此并排地處在這種插頭中。插頭23與檢測器行24的幾何結構相匹配地設計，也就是光導纖維21的每個輸出端方面的端部恰好處在檢測器行24的像素25前方。

需要指出的是，根據圖2的平面檢測器19的實施方案是純示例性的。原則上對于顯微鏡1足夠的是如下的平面顯微鏡19，這種平面顯微鏡在檢測器平面18中執行對衍射圖17的過采樣，衍射圖在焦平面29中產生以照明點位14照明的點受衍射限制的成像。特別是可以在平面檢測器19中也指的是檢測平面18中矩形的檢測器平面，正如其在下面介紹的圖4至圖6中的情況那樣。

在顯微鏡1的說明中，迄今未提到元件15。其指的是光譜選擇性的元件，其布置在成像裝置4中或照明裝置3中。光譜選擇性的元件15在圖1的圖示中針對照明裝置3中的結構僅虛線示出。在下面，首先對成型裝置4中光譜選擇性的元件15的作用和結構加以闡釋。

在沒有光譜選擇性的元件15的情況下，在對利用光斑14照亮的點在焦平面29中受衍射限制地成像時，在所對應的共軛檢測平面18中產生衍射圖17，衍射圖基于物鏡13的圓形的孔徑而是衍射艾里斑。這種衍射艾里斑的產生一般性地在說明書中已經介紹。對于顯微術，如其在EP2317362A1中介紹那樣，通過的衍射圖17過采樣，對其結構加以分析，在結合具有小于光斑14的最小尺寸的步進幅度的掃描位置下，可以實現超越受衍射限制的成像的分辨率極限的結構解析度。為了闡釋可以考慮對兩個在焦平面29中以受衍射限制的分辨率不能檢測到的緊密程度并排而置的部位進行觀察。在利用小于(在理想實驗中為圓形的)光斑的直徑的步進幅度掃描光斑14時，首先兩個部位中的一個達到光斑14。該第一部位進入光斑14越多，衍射圖17中的輻射強度就越大。光斑14基于其受衍射限制的特性而朝向中心強度增大。由此，衍射圖14中的輻射強度隨著所觀察的第一部位逐漸移入光斑14的中心而增大。當光斑14的中心移位超出所觀察的部位時，該第一部位的輻射強度再次降低。當理想設定的第二部位不相鄰時，衍射圖17中的輻射強度再度逐漸消失，其中，衍射圖17中輻射強度的升高和降低與光斑14的照明強度的分布(在考慮到步進幅度和第一部位的熒光敏感性的情況下)具有精確的相關性。但因為這時第二部位緊密相鄰的存在，所以第二部位同樣有助于對衍射圖17的熒光輻射，具體來講，光斑14的中心距第二部位越近，輻射強度就越大。其他方面，針對第二部位恰適用針對第一部位的相同方案。這樣，針對步進位置，在衍射圖17中的照明強度獲得不同于存在單獨的發熒光的部位的情況。通過評估平面檢測器19的數據以及顧及到當前的掃描位置，則能夠以數學方法獲得：焦平面29中的兩個部位發熒光以及以多大間距發熒光，盡管這兩個利用受衍射限制的分辨率本身不能得到單獨分辨。在本領域技術人員已知的方案中，為了評估平面檢測器19的數據，針對每個掃描位置列出包含多個未知數的方程，特別是包含焦平面29中的部位的強度和間距。通過多個掃描位置，獲得方程組，方程組是超定的并且允許：獲知輻射強度和間距，也就是由此也獲知發熒光的部位的位置。這在下面還要詳細闡釋。

高分辨率顯微成像的原理利用顯微鏡1在這里進行如下展開：光譜選擇性的元件15在相對于焦平面29共軛的檢測平面18中以如下方式改變衍射圖17：針對兩個波長范圍(色彩波道)產生兩個彼此相對移位的衍射艾里斑。由此，作為衍射圖代表的是圖3中所示的情況。在示例標繪為像素22的方形陣列的平面檢測器19上，兩個衍射艾里斑30、31彼此相對移位地設置，其中，其中一個衍射艾里斑30對應于第一色彩波道，第二衍射艾里斑31對應于第二色彩波道。色彩波道的波長極限通過光譜選擇性的元件來限定，光譜選擇性的元件因此在一個實施方式中與預先確定的色彩波道(波長范圍)相匹配地選定。衍射艾里斑30、31在一種實施方案中彼此相對以如下方式錯位，使得其中心(通過大圓點標示)處在相應其他衍射艾里斑的相疊區域之外。

衍射艾里斑30和31的組合構成衍射圖17，也就是衍射艾里斑在顯微成像期間在空間上不移動。在根據EP2317362的顯微鏡中原來作為唯一的衍射艾里斑存在的衍射圖17在這時被兩個衍射艾里斑30和31替代。

當再次理想地觀察兩個處在焦平面29中的、間隔緊密的部位時，這兩個部位利用受衍射限制的成像方式基本不能被分辨出來，在顯微鏡1中基于光譜選擇性的元件15調整出如下的表現，當假設第一色彩波道中的第一部位與衍射艾里斑30相對應地，并且第二色彩波道中的第二部位對應衍射艾里31地，發出熒光：一旦光斑14檢測到第一部位，在衍射圖17中第一衍射艾里斑30就被照亮。相反，第二衍射艾里斑31還是暗的，因為只要第二部位也沒被光斑14照亮，就沒有輻射在第二色彩波道中到達。衍射艾里斑30中的強度一直升高，直到第一部位被光斑14的中心檢測到。這樣，第一色彩波道的衍射艾里斑30中的強度最大。類似的情況下適用于衍射艾里斑31和第二色彩波道以及第二部位。這樣，在光斑14經過所述兩個部位時，實現了第一衍射艾里斑30的變亮和變暗，以及第二衍射艾里斑31在時間上稍遲出現的變亮和變暗。

對平面檢測器19的數據在與掃描位置相組合下進行的評估實現了：針對每個掃描位置列出方程，其不僅包含兩個部位的位置和熒光強度，還包括對第一還是第二部位在第一或第二色彩波道中(前提是對應關系當然是未知的)被照亮給出預判。通過多個掃描位置獲得超定的方程組，這實現了：也獲知發光的部位與兩個色彩波道的附加對應關系。

按照這種方式，顯微鏡1和所對應的顯微成像方法在高分辨率的圖中的兩個波長范圍(色彩波道)之間進行區分，并且在無附加檢測器的情況下獲得雙色圖像。

需要指出的是，衍射艾里斑30和31的間距在顯微成像時保持恒定，特別是間距不表示顏色信息。其僅用于使衍射艾里斑30和31在空間上不完全重疊而置，因為這樣衍射艾里斑就區分不開了。

當然也能夠以如下方式區分衍射艾里斑不發生交疊。但這樣就需要相對較大的檢測器。

衍射艾里斑30和31在光譜選擇性的元件15的實施方式中，如其針對圖3所用那樣，具有相同的直徑。但在說明書的通用部分中提到的是，衍射艾里斑的尺寸與波長相關。因此，可以實際預計出：較短波長的衍射光斑(例如衍射艾里斑30)必須具有比較長波長的衍射艾里斑(例如衍射艾里斑31)更大的直徑。這種情況也存在于圖4中。在圖3中，沒有給出這種情況，因為光譜選擇性的元件15在輻射被分光時產生色譜補償，這使得衍射艾里斑30和31盡管其色彩波道不同，也是一樣大的。

所介紹的方案不僅限于兩個波長范圍(色彩波道)的應用。圖5示出具有第三色彩波道31的結構，在圖6中葉存在第四色彩波道33。開頭所述的內容在這里同樣類似適用。因此，多個色彩波道是可行的，因為基于多個掃描位置，所獲得的方程組以如下方式超定，可以說還有存在用于其他呈色彩波道類型的未知量的位置。

在迄今的介紹中，出發點在于，光譜選擇性的元件15處在成像裝置4中并且在那里是光路的一部分，其僅用于成像。換言之，光譜選擇性的元件5在本實施方式中不被照明輻射穿過。由光譜選擇性的元件15通過衍射艾里斑彼此相對移位而產生的色彩波道由此是發射熒光的試樣的色彩波道。顯微鏡或顯微成像方法的這種實施方式將熒光輻射在其波長范圍(色彩波道方面)做出區分。

但是，光譜選擇性的元件15也可以布置在照明裝置3中。這種結構在圖1中以虛線示出。這樣，光譜選擇性的元件處在光路的僅被照明輻射穿過的區域中，由此其不影響成像，而是僅影響照明。這樣，光譜選擇性的元件15將光斑14分成兩個照明衍射艾里斑34、35，正如在圖7的圖示中所示那樣。由此，照明光路中的光譜選擇性的元件15給出了照明色彩波道，相反，光譜選擇性的元件15在成像光路中的布置產生了檢測色彩波道。由此，試樣不再被一個例如衍射艾里斑照亮，而是被兩個彼此錯開的照明衍射艾里斑34和35照亮。這樣，由此也在平面檢測器19上獲得了如圖3中的情況，其中，衍射艾里斑30和31在這時不再對應于熒光輻射的不同色彩波道，也就是試樣2的熒光應答，而是對應于激發的不同色彩波道，也就是試樣2的熒光敏感度。在其他方面，借助于圖3至圖6針對光譜選擇性的元件15在成像裝置4中的布置闡釋的所有變型同樣也能夠用于光譜選擇性的元件15在照明裝置3中的可替換的布置。但基于其他幾何位置，一般光譜選擇性的元件15的設計在成像裝置4的結構中看起來不同于在照明裝置3中的結構。原則上，可以針對光譜選擇性的元件，考慮多個具有色譜效果的元件，例如楔、棱鏡、反射鏡或雙合透鏡。

在針對上面提到的可替換方案的變型中，光譜選擇性的元件15可也可以設置在光路的在照明時以及在成像時都經過的部分中，或者使用兩個光譜選擇性的元件15。按照這種方式可以在以一個波長同時激發兩種顏色時，抑制發生串道。附加地，獲得了針對校準測量的可行方案。

在將光譜選擇性的元件15布置在照明裝置3中時，可以出現如下情況，在利用兩個或更多個色彩波道照明時，較短的照明波長在較長波長的照明所產生的熒光的波長范圍中產生熒光信號。結果是，其中一個結構作為移位的陰影像再次出現。借助于適當的相關計算，可以確定并去除陰影像部分。

根據圖3和圖4的實施方式示出：優選的是，衍射艾里斑的移位沿著平面檢測器19的對角線進行。因為這樣平面檢測器的面積能夠得到最大程度利用。

在使用具有如在圖2中示意示出的光導纖維的平面檢測器19時，優選的是，以如下方式敷設纖維，使得兩個衍射艾里斑的不交疊的區域引導到彼此盡可能相鄰設置的檢測器元件上，也就是衍射艾里斑30的不相疊的區域被引導到第一組檢測器元件上，衍射艾里斑31的不相疊的區域被引導到第二組檢測器元件上，其中，這兩個組盡可能不相互交叉干擾。

為了更精確地闡釋方程組列出的數學分析，為了導入，首先考慮如下情況，僅出現一種顏色，也就是缺少光譜選擇性的元件15。當人們以O(r)標示物體，以E(r)標示激發的點擴散函數(PSF)，以H(r)標示檢測的PSF時，作為針對每個像點的信號D(r，p)獲得了下列方程式，其中r表示與光斑的位置p的間距：

關于位置p的傅里葉變換D(r，p)給出：

D(r，ω)＝O(ω)FT_r′{E(r′)H(r′+r)} (2)

實域中的乘積給出傅里葉域中卷積：

當導入位置r上的支撐函數時：

EH(r，ω)＝FT_r′{E(r′)H(r′+r)} (4)

獲得方程(2)

D(r，ω)＝O(ω)EH(r，ω) (5)

平面檢測器上的不同的位置r借助于維納濾波器組合

其中，<|O(ω)|²>和<|n(ω)|²>是信號(“O”)和噪聲(n)信號的相應的功率密度。已經事先給出的是，針對多個在平面檢測器19的每個像素上混合的色彩波道，通過PSF給定的加權如下：

在該方程中，C是色彩波道技術下標，方程(7)作為矩陣獲得：

[D(r，ω)]_r＝[O_c(ω)]_c[EH_c(r，ω)]_c，r (8)