功能集成的激光掃描顯微鏡的制作方法

本發明涉及一種功能集成的激光掃描顯微鏡，其被構造用于可選地以共焦運行模式、行運行模式或寬場運行模式利用激光照射裝置對試樣加以掃描。

背景技術：

共焦激光掃描顯微鏡是已知的。在此情況下，需要查看的試樣區域被利用聚焦到一點的激光束加以掃描，針對所有被掃描的位置而言，借助于圖像傳感器來測量被試樣物質反射或通過熒光性發出的光的特性，并且基于測量結果產生試樣區域的圖像。

在將激光掃描顯微鏡應用于生物醫藥領域的研究時，在過去的幾年中，對活細胞的研究越來越在經濟利益方面具有前景，例如為了細胞中新陳代謝過程的研究或者為了分析藥物對細胞生理的作用。在此，熒光顯微鏡有特別意義，因為熒光顯微鏡實現了對不同細胞器具有高區分度的、亞細胞級的光學觀察，并且顯微鏡從單純的圖像產生系統發展成重要的測量工具。但是，對活細胞的研究對顯微鏡系統提出高要求。一方面，數據獲得必須非常迅速執行，以便能夠追蹤生物過程的時間過程，另一方面，確保細胞的生命維持或者將對細胞新陳代謝的干擾降得很低。這需要在激勵熒光分子時將盡可能少的光引入細胞中，但這種光引入不應妨礙到信噪比(SNR)，由此，能夠盡可能迅速而且準確地獲取所需要的信息。

這種部分彼此矛盾的需求的滿足是繼續研發激光掃描顯微鏡時重要的挑戰。

難點在于，共焦的圖像生成由于呈點狀順次的數據生成而在其圖像采集速率方面受到限制。雖然圖像采集速率能夠通過借助于共振電流計掃描儀的更為快速的采樣而提高，但是由此每個圖像傳感器的蓄電時間相應縮短。為了盡管如此仍實現所希望的信噪比，必須密集地或者說高強度地照射，這又提高了對活體試樣的毒性負擔。

在獲取共焦圖像時提高速率的另一可行方案是利用所謂的轉盤式(SDM)顯微鏡得以實現。在這里，借助于兩個耦合旋轉的盤(其中，第一個盤承載微型透鏡，在第二個盤上布置有對應于這個微型透鏡的共焦遮光板)通過并行設置來實現圖像采集速率的顯著提高。但是，圖像采集速率受到圖像傳感器特性的限制。此外，轉盤式顯微鏡就圖像產生的功能方面特殊設定，此外，進行中的測量任務，諸如熒光壽命成像顯微術(FLIM)、熒光共振能量轉移試驗(FRET)或熒光相關譜不能應用或應用不足。

最后，光譜成像也不適合于，能夠將試樣的多重染色明晰地相互區分并且對細胞中的變換過程加以分析。借助于轉盤式顯微術或借助于寬場顯微術的光譜成像雖然在文獻中被多次討論，但是迄今沒有在商用方面付諸實踐。

由此，根據現有技術雖然能夠提供各種針對特定用途特殊設計的激光掃描顯微系統，但是不能實現滿足廣泛通用要求的功能整合系統和更全面的應用。

針對共焦直至寬場顯微術所提出的設備組合例如是制造商尼康的共焦激光掃描顯微鏡C2，這種顯微鏡模塊化地由不同的光學部件構造，這些光學部件根據應用能夠彼此替換和相互關聯。

但是，需要解決的問題總是還在于當觀察試樣期間提供共焦運行模式、行運行模式或寬場運行模式，而無須耗時地執行模式更換或設備改造。

技術實現要素：

由此出發，本發明的目的在于，提出一種激光掃描顯微鏡，其具有不同的、能夠預選的運行模式，這些運行模式實現了：使顯微鏡以簡單方式針對相應的實驗需要來構造。

所述目的利用開頭提到類型的激光掃描顯微鏡來實現，所述激光掃描顯微鏡包括：

激光光源、照射和檢測光路、檢測裝置以及至少一個物鏡，分別針對每一種所選運行模式的使用來設計，其中，

照射和檢測光路包括用于構造激光照射裝置的機構、至少一個用于利用激光照射裝置對試樣進行掃描的掃描儀以及用于將照射和檢測光分離的分束器，以及

在檢測光路中設置有用于根據相應選擇的運行模式改變光線引導的、能夠控制的光學元件。

能夠控制的結構組件借助于指令輸入裝置與控制電路相連接，所述控制電路設計用于將當前的運行模式轉換為所希望的其他運行模式，存在用以基于由檢測裝置輸出的電子圖像信號來生成試樣圖像的硬件和軟件。

激光照射裝置的概念在本發明的意義上包括對試樣或試樣需要查看的區域的點狀、線狀的照射裝置，也包括場狀的照射裝置。對照射光點狀、線狀或場狀的設計借助于能夠控制的光學元件根據各自所希望的運行模式來實現。

按照本發明設計有前面介紹的特征的激光掃描顯微鏡通過避免模塊化的結構類型、以簡單的方式通過轉換到相應的運行模式而實現了：

迅速而又保護試樣地獲得了需要查看的試樣區域的總覽圖，

在最高30fps(每秒傳輸幀數)的圖像采集速率下以光譜成像產生共焦的圖像照片，或者在試樣負擔最小而且信噪比很高的情況下，產生上述圖像照片，

以光譜成像在圖像采集速率高于100fps的情況下產生超高速的圖像照片，或者

對試樣中所希望的區域拍攝并行的二維圖像。

在此，上面提到的、最高至30fps或者高于100fps的圖像采集速率分別涉及的是每張圖512行，這里假設圖像采集速率由于行速度而受到限制。在產生并行的二維圖像時的圖像采集速率首先通過圖像傳感器的具體幾何形狀來給定，但也可以通過摩賽克方法來檢測試樣的更大的區域。

光線引導根據相應選定的運行模式的改變通過借助于能夠控制的光學切換元件將檢測光束耦合輸入到不同的檢測路徑中來設置。檢測路徑通過處在光路中的光學結構組件和/或通過至少一個圖像平面和光瞳平面的位置來區分。分別將一個檢測路徑固定配設給一個運行模式。

在第一檢測路徑中，檢測光束的貫穿引導和影響借助于至少一個相對于底座固定布置在光路中的光學結構組件來設置，而在第二檢測路徑中，檢測光路圍繞所述光學結構組件的圍繞引導地設置，以便避免產生影響。由此，在第一檢測路徑中、在定義的位置上構造出圖像平面，在第二檢測路徑中替代圖像平面地構造出光瞳平面。例如將透鏡陣列設置為相對于底座固定的光學結構組件。

優選的是，將第一檢測路徑配設給共焦運行模式，第二檢測路徑配設給行運行模式和寬場運行模式。

在檢測光路的繼續延伸中，可以存在第二光學切換元件，利用第二光學切換元件、根據切換位置將經相應的檢測路徑而來的檢測光束耦合輸入到共同的檢測裝置中。

作為第一切換元件存在的例如是切換鏡，可以設置為第二切換元件的是能夠運動的棱鏡。

光學切換元件與控制電路相連接，控制電路根據相應的運行模式規定或者說預設出切換位置。控制電路與指令輸入裝置相聯接，用于轉換運行模式。

按照本發明的激光掃描顯微鏡的照射光路具有照射掃描儀，用于使激光照射裝置運動超出物鏡光瞳和/或用于使照射光線引導與相應調整出的運行模式相匹配。在此，運動圖案或運動過程與相應選定的運動模式相關，也就是照射掃描儀的操控同樣與運行模式相關地執行。此外，在照射光路中同樣設置有能夠控制的光學結構組件，用于根據相應選定的運行模式來改變光線引導，并且與控制電路相連接。

在按照本發明的激光掃描顯微鏡的優選實施方式中：

在共焦運行模式期間，透鏡結構組件被樞轉進入照射光路中，

在行運行模式期間，透鏡結構組件和柱面透鏡被樞轉進入照射光路中，以及

在寬場運行模式期間，替代透鏡結構組件和柱面透鏡地將望遠鏡或者說鏡管樞轉進入照射光路中。

能夠樞轉進入的結構組件的功能和目的接下來在后面借助于實施例詳細闡釋。樞轉進入或樞轉擺出的過程借助于控制電路根據所規定或者說預設的運行模式來實現。

此外，可以考慮而且落在本發明范圍內的是，針對各個運行模式的光線形成通過借助于空間光調制器(SLM)在相對于物鏡光瞳共軛的平面中操作激光光線的相位來實現。

在特別優選的實施方式中，針對所有運行模式共同的檢測裝置具有光電子圖像傳感器，圖像傳感器的傳感器像素為了激活和停用而能夠分別得到控制。圖像傳感器或各個傳感器像素的操控借助于控制電路根據所規定或者說預設的運行模式來實現。

圖像傳感器具有傳感器像素的二維布置方式，使得與轉盤式技術相對應地可行的是：通過以多個點進行并行的激勵和檢測，而迅速并且保護試樣地獲取共焦的圖像。在有利的實施方案中，每個傳感器像素借助于控制電路能夠被個別激活或停用，多個傳感器像素能夠以可變方式分組集中，并且傳感器面上多個彼此獨立有待讀取的像素區域能夠自由編程。

在寬場掃描運行模式的情況下，二維的傳感器矩陣的中的每個像素對于試樣位置相對應的發射強度進行記錄。傳感器的被讀取的數據由此獲得黑白的分圖。在共焦的而且行照射的運行模式中，可以借助于附加的光學結構與每個傳感器像素相對應的是所對應的試樣位置在定義的光譜帶內的發射強度。在此情況下，光譜信息基本上垂直于位置信息地分布于傳感器面上。由此，實現了在這種運行模式中的光譜成像。

由此出發，考慮作為圖像傳感器的優選是雪崩光電二極管的矩陣。適合作為圖像傳感器的例如還有混合檢測器或光電倍增管的矩陣結構。

雪崩光電二極管的陣列相對于光電倍增管布置的優點為：

較小的傳感元件，由此實現照相機類型的運行，

在一定面積上可以設置多個元件，

能夠實現在背面照射裝置上直至100％的填充系數。

就此而言，本發明的設想主要在于：以一個且為同一圖像傳感器實現多焦點的圖像生成、行圖像生成以及寬場圖像生成。在模式之間能夠簡單而且迅速切換，方式為：操控較少的可變的光學結構組件，并且圖像傳感器同樣借助于直接的變換編程得到匹配。

按照本發明的激光掃描顯微鏡優選設計用于利用照射光作為激勵光束而且利用由其產生的熒光作為檢測光束的熒光顯微術。

附圖說明

下面，借助于附圖詳細闡述本發明。其中：

圖1示出按照本發明的激光掃描顯微鏡的原理圖示，

圖2示出針對多共焦顯微術的運行模式的照射和檢測光路的構造的示例，

圖3示出針對寬場顯微術的運行模式的照射和檢測光路的構造的示例，

圖4示出針對行掃描顯微術的運行模式的照射和檢測光路的構造的示例，

圖5示出針對前述區域中的檢測光路的構造方案的涉及多共焦顯微術的運行模式的另一示例，

圖6示出針對前述區域中的檢測光路的構造方案的涉及行掃描顯微術的運行模式的示例。

具體實施方式

在圖1中示出的圖示對按照本發明的激光掃描顯微鏡的原理性構造加以說明，其例如構造用于熒光顯微術。

設置有激光單元和檢測裝置，所述激光單元和檢測裝置能夠根據共焦運行模式、行運行模式或寬場運行模式編程，也就是不需要不同激光單元和/或檢測裝置在變換運行模式時的更換。

基本上，在變換運行模式期間，保持獲得照射和檢測光路，僅在光路中存在一些能夠可變控制的光學結構組件，這些光學結構組件被構造用于匹配光線引導(參見圖2至圖4)。能夠控制的光學結構組件本身、顯微鏡系統的光學基礎元件(諸如主分色器(HFT)和光線折轉元件)以及物鏡與所選運行模式無關地相對于底座固定地保持在其位置中。試樣為了定位目的、如現有技術已知那樣，借助于優選設有馬達或者說馬達驅動的試樣臺面而能夠相對于物鏡在坐標系x、y、z中運動。

指令輸入裝置與控制電路相連接，指令輸入裝置用于手動規定出各自所希望的運行模式。

在圖2中，示出了在共焦或多共焦顯微術中在圖像生成模式中用于照射和檢測的光路，在最佳的光譜功能下實現了大約30fps的圖像采樣速率。

在達到主分色器HFT的照射光路中，設置為能夠控制的光學結構組件的是能夠樞轉擺入的柱面透鏡(可替換地也可以是Powel透鏡)、照射掃描儀S1以及借助于樞轉軸能夠轉動地支承的變換光學器件，具有單透鏡L3和由透鏡L1、L2組成的望遠鏡或者說鏡管。

在共焦或多共焦掃描的這里示例介紹的情況下，單透鏡L3樞轉擺入照射光路中。在主分色器HFT上反射的照射光憑借都處在相對于物鏡光瞳共軛的平面中的切換鏡和系統掃描儀S2朝向物鏡的方向折轉。在多共焦運行模式中，將多個激光光線耦合輸入到系統中，激光光線呈彼此間具有固定角度關系的扇形的形狀撐開。這種扇形垂直于圖2的標志平面取向，也就是多個激光光線彼此前后處在標志平面中。光線彼此間的角度關系與透鏡陣列的節距相匹配。照射掃描儀S1以如下方式調整，使得光束沿后續的光學器件的軸引導。

由L3和L4組成的透鏡系統在切換鏡上成像出照射掃描儀S1，而L5在系統掃描儀S2上成像出切換鏡。照射掃描儀S2和切換鏡由此都相對于物鏡光瞳共軛地安置。

由此，光瞳分別處在照射掃描儀S1、切換鏡、系統掃描儀S2上以及在物鏡中，在光瞳中疊加所有激勵光線。每個分光線由此產生物體空間中的一個光斑，其中，所述光斑沿一條線布置。光斑圖案借助于系統掃描儀S2在試樣上運動。光斑的數目借助于接通或遮擋分光線來調整。用于產生多個分光線的機構由現有技術已知，并且在這里不需要詳細介紹。

在例如能夠作為凹口濾波器的主分色器(HFT)上將照射光與檢測光分離。

沿著檢測光路布置切換鏡和透鏡L6，所述透鏡產生圖像平面，在圖像平面中存在(關于其他兩種運行模式借助于操控可變的)縫隙孔板。透鏡L6的圖像平面還處在后續的透鏡陣列和具有(關于其他兩種運行模式借助于操控可變的)小孔的小孔光學器件的掃描儀方面的焦平面中。小孔布置在透鏡L7的傳感器方面的圖像平面中。相對于小孔在后布置了由L8至L10組成的透鏡系統，所述透鏡系統將射線成像到檢測裝置上。能夠移動的棱鏡根據所調整的運行模式對從試樣中發出的射線在傳感器矩陣上的位置加以優化。

發出自物體空間中的激光照射位置的射線借助于系統掃描儀S2掃描，并且利用切換鏡沿小孔光學器件的光軸取向。特別是切換鏡和主分色器HFT組成的組合以如下方式調整，使得每個分光線借助于透鏡陣列中與其對應的透鏡而被準直化。因為分光線圍繞相對于透鏡陣列在前安置的中間圖在縫隙孔板的位置中遠心地(telezentrisch)引導，所以借助于透鏡陣列實現并行光線引導的傳輸。分光線穿過小孔在后面成像到檢測裝置的圖像傳感器上。檢測裝置優選構造有雪崩光電二極管陣列來作為圖像傳感器。

既在共焦運行模式也在其他兩種運行模式中，在縫隙孔板的位置中，始終安放圖像平面，所述圖像平面同時既處在透鏡陣列的焦平面中，也處在透鏡L7的焦平面中。

在圖2中示出的共焦的運行模式原則上與按照本發明的功能集成的激光掃描顯微鏡的基本模式相同。在這種模式中，如從圖2中所見那樣，檢測光束穿過透鏡陣列引導。處在透鏡陣列的相應光軸上的激光光斑作為分光線借助于透鏡陣列準直化并且遠心地繼續引導至透鏡L7，所述透鏡將遠心的準直的分光線聚焦到小孔平面中的共同的點上。因此，僅需要將小孔的孔徑減小至所希望的尺寸，在這種運行模式中，例如減小到對應于通氣單元的開口直徑。

在其他兩個運行模式中，借助于行狀或平面的激勵，實現了半共焦或場掃描的圖像生成，透鏡陣列在光路中會產生干擾，因為透鏡陣列將像場很大程度地分段。因此，在這些情況下，檢測光束利用切換鏡折轉到單獨的檢測路徑中，并且這樣從旁邊引導經過透鏡陣列。

透鏡L7在共焦的運行模式中將所有分光線成像到小孔平面中的光軸上，而小孔平面作為其他兩個運行模式(也就是在場構型或行構型)中的透鏡L7的后焦點平面，相對于物鏡光瞳共軛(參見針對圖3和圖4的闡釋)。

由L8和L9組成的透鏡系統是將小孔平面成像到與檢測光學器件的接口中的中繼系統。透鏡L10象征性代表檢測光學器件。

由此，獲得了對所有可選的運行模式之間按照本發明的可變換性給予輔助的結構的下列的有利特性：

透鏡陣列上的小孔徑，

透鏡L7上的大孔徑，

圖像平面上的縫隙孔板，

透鏡陣列的掃描儀方面的焦平面和透鏡L7共同處在縫隙孔板的位置中，

縫隙孔板能夠可控地圍繞縫隙以如下程度打開，使得分場或者分區域能夠得到傳輸，

小孔是能夠控制的，以便其至少打開至存在于小孔平面中的光瞳邊緣部。

作為不同于上述說明書的設計變型可以使照射光線的鏡面成像在透鏡陣列與小孔光學器件之間的檢測光路中實現。這樣，分光線已經在照射光路中平行引導。

通過減少分光束的數目，當然能夠替代多共焦圖像生成地也實施單焦的運行，正如由激光掃描顯微術的現有技術已知那樣。

圖3示出在寬場掃描顯微術或場掃描顯微術的運行模式中照射和檢測光路的構造示例。

在這里示出的情況下，由透鏡L1、L2構成的望遠鏡替代單透鏡L3樞轉進入照射光路中。由主分色器HFT反射的照射光利用切換鏡和系統掃描儀S2又朝向物鏡的方形折轉，其中，在切換鏡和系統掃描儀上產生激光焦點，激光焦點以照射掃描儀S1的盡可能迅速的掃描運動在光瞳平面上運動。

按照這種方式在物鏡的整個場中激勵出的熒光在從試樣返回的行程上完全照亮物鏡光瞳。物鏡光瞳被成像到系統掃描儀S2和切換鏡上的共軛的平面中。切換鏡在場掃描的所示的情況中通過操控而得到如下調整，能夠傳輸的場從主分色器HFT發射，在特定的檢測路徑上離軸地從旁邊折轉經過透鏡陣列。

布置在檢測光路中的可變的小孔還有透鏡陣列前面的可變的縫隙孔板都在這里示出的運行模式中繼續打開。

系統掃描儀S2借助于通過操控調整出的移位角來確定所成像的分場在顯微鏡物鏡的所提供的物體場中的位置。可選地，場孔板(未示出)也能夠在第一中間圖像平面中在物鏡后面與掃描儀移位共同運動，以便使對可檢測的物體場之外的試樣區域的過度照射得到避免或降至最低程度。

可替換地，可以在此處設置照射變焦裝置，以便限制照射的數值孔徑(NA)，進而對被照亮的物體場的尺寸加以監控。但是，NA的匹配也可以設置在變化光學器件中，并且以如下方式設計，使得能夠傳輸的場被完全照亮。

圖4示出直線掃描模式的光路。在這種情況下，柱面透鏡被調至照射光路中，使得在照射掃描儀S1上產生行狀光分布，其中，照射掃描儀S1處在柱面透鏡的焦平面中。變化光學器件使得單透鏡L3處在照射光路中。由此，光瞳平面又處在照射掃描儀S1、切換鏡、系統掃描儀S2上并且處在物鏡中。然后，物鏡在物體空間中產生線狀焦點，線狀焦點利用系統掃描儀S2垂直于線方向被掃描并且借助于移位角定位。

從線焦點發出的射線借助于系統掃描儀S2掃描，并且在切換鏡相應的位置中從旁邊經過透鏡陣列。中間圖像中在透鏡陣列之前的縫隙孔板達到所希望的寬度，以便實現半共焦的檢測。在后布置的小孔最大程度敞開。能夠移位的棱鏡將行分布的中心拉到檢測光學器件的圖像傳感器的軸上。圖像傳感器在行掃描模式的情況下處在與縫隙共軛的圖像平面中。

在同樣落在本發明構思范圍內的設計變型中，與上面結合圖2至圖4的說明書不同地，能夠移動的棱鏡的優選位置根據運行模式而定，不是使所傳輸的場的中心折轉到后續光學器件的軸上的相應位置，而是使針對相應選定的運行模式的圖像傳感器能夠得到最高效利用的相應位置。

具體來講，這意味著：

a.在場掃描的情況下，所傳輸的場相對于圖像傳感器的中心對稱地成像到圖像傳感器上，

b.在行掃描的情況下，行狀的射線分布垂直于行取向地利用棱鏡或光柵發生光譜色散，或者行的呈光譜分開的圖像與傳感器的中心對稱地成像到圖像傳感器上，或自所選定的起始波長開始，在傳感器邊緣成像到圖像傳感器上，

c.在多共焦掃描的情況下，各分光線通過另一透鏡陣列引導，而對射線分布接下來進行的光譜成像類似于針對行掃描的說明來進行。

針對b)和c)所需的檢測光路變換例如可以借助于能夠移動的棱鏡來實現。這在圖5和圖6中示意示出。

在圖5中借助于針對多共焦運行的示例，更詳細地示出了從能夠移動的棱鏡到傳感器平面的光路。圖5a)示出檢測光路的俯視圖，而圖5b示出檢測光路的側視圖。相對于能夠移動的棱鏡在后布置的是兩個中繼光學器件，其由透鏡對L11/L12和L13/L14組成，中繼光學器件將射線成像到傳感器平面中。在兩個中繼光學器件之間存在一透鏡陣列，其又相對于底座固定地布置。

在多共焦運行的這里所示情況下，能夠移動的棱鏡以如下方式調整，使得射線由所述透鏡陣列引導。由此，分光線被成像到后續的中繼光學器件的焦平面中。在透鏡L13與透鏡L14之間，分光線準直化并且以彼此固定的角度關系來引導。在L13和L14的共同的焦平面中存在色散元件，例如將在分光線中引導的射線分解成其光譜組成部分的棱鏡。有利的是，色散方向垂直于由分光線撐開的扇形。透鏡L14將發生光譜色散的射線成像到傳感器上。在此，光斑和光譜有利地彼此垂直布置。

傳感器在這時獨立于所選的運行模式地處在相對于試樣共軛的平面中。相反，在其他兩種運行模式中，也就是在行掃描和場掃描中，檢測射束從旁邊引導經過透鏡陣列。

在行掃描的運行模式中，能夠移動的透鏡如在圖6中所示那樣，以如下方式調整，使得射線從旁邊引導經過透鏡陣列。在圖像傳感器上的光譜分層針對多共焦運動模式(圖5)以及行掃描運行模式(圖6)以同一色散元件產生。光譜在傳感器矩陣上的位置在需要時通過轉動色散光學元件來實現，這正如圖5中結合多共焦模式以及圖6中結合行掃描模式可知那樣。針對場掃描模式，色散元件從從光路中移走。

光瞳與場之間的轉換原則上可以利用能夠樞轉擺入的伯特蘭透鏡來實現，或者借助于能夠切換的光路來實現。用于切換的元件如所列舉地有用于角度分離的鏡(優選為微機電系統(MEMS))、用于旁側分離的平板或者適用于這兩者的棱鏡。