用于定位點狀樣本的光學顯微機構的制作方法

本實用新型涉及一種用于定位試樣中的點狀樣本的光學顯微方法，按照該方法，借助成像鏡頭使得設置在樣本空間中的試樣成像到探測器上，該成像鏡頭在樣本空間中沿著其光軸具有預定軸向延展距離的清晰深度區域，在清晰深度區域內對在試樣中含有的點狀樣本定位，其方式為，對因試樣成像到探測器上而產生的第一試樣圖像加以分析，其中，為了在光軸方向上定位相應的點狀樣本，求取第一試樣圖像的表示點狀樣本的光斑的特征參數，并根據預定的指配信息給該特征參數指配涉及點狀樣本的軸向位置。

背景技術：

近來研發出了光學顯微成像法，采用這種方法可以基于對各個標記特別是熒光分子的順序的隨機的定位來顯示比傳統的光學顯微術的由運動引起的分辨率極限更小的試樣結構。這種方法例如記載在WO 2006/127692 A2；DE 10 2006 021 317 B3；WO 2007/128434 A1、US 2009/0134342 A1；DE 10 2008 024 568 A1；WO 2008/091296 A2；“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)(采用隨機光學重建顯微法(STORM)的子衍射極限成像)”，Nature Methods(自然，方法)3，793-796(2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“Resolution of Lambda/10in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching(在采用幾乎單分子光切換的熒光顯微術中的λ/10分辨率)”，Geisler C.等人，Appl.Phys.A，88,223-226(2007)中。顯微術的這種新分支也稱為定位顯微術。所采用的方法在例如名為(F)PALM((Fluorescence)Photoactivation Localization Microscopy)、PALMIRA(PALM with Independently Running Acquisition)、GSD(IM)(Ground State Depletion Individual Molecule Return)Microscopy)或(F)STORM((Fluorescence)Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)的文獻中已知。

這些新方法的共同點是，制備要成像的帶有點狀樣品即所謂的標記的試樣結構，這些標記具有兩個可區分開的狀態，即“亮”態和“暗”態。如果例如使用熒光顏料作為標記，則亮態就是能夠發熒光的狀態，而暗態就是不能發熒光的狀態。

在優選的實施方式中，例如在WO 2008/091296 A2和WO 2006/127692 A2中，使用了可光切換或可光激活的熒光分子。替代地，如在DE 10 2006 021 317 B3中，可以使用標準熒光分子的固有的暗態。

為了以高于成像鏡頭的傳統的分辨率極限的分辨率來對試樣結構予以成像，現在重復地將小部分量的標記轉變為亮態。在此，在最簡單的情況下，適當地選擇形成這些激活的部分量的標記的密度，使得在亮態下進而在可采用光學顯微術成像的狀態下相鄰標記的平均距離大于成像鏡頭的分辨率極限。形成激活的部分量的那些標記被成像在有空間分辨性的光學探測器例如CCD攝像機上，從而由每個點狀標記檢測光斑形式的光分布，所述光斑的大小由鏡頭的分辨率極限確定。

通過這種方式來攝取多個原初數據-單圖像，在這些圖像中分別成像了另一個激活的部分量。然后在圖像分析過程中，在每個原初數據-單圖像內確定光分布的重心位置，其顯示出處于亮態的點狀標記。由原初數據-單圖像求取的那些光分布重心位置然后在整個顯示中以整個圖像-數據組的形式被匯總。通過該整個顯示產生的高分辨率的整個圖像反映了標記的分布。

為了有代表性地反映要成像的試樣結構，必須探測足夠多的標記信號。但由于在激活的各部分量中標記的數量受限于兩個標記在亮態下相互間必須具備的最小的平均距離，所以必須攝取很多原初數據-單圖像，以便完全對試樣結構予以成像。原初數據-單圖像的數量通常處于10000-100000的范圍內。

除了按上述在樣本平面(下面也稱為x-y平面)上對標記進行橫向的位置確定外，也可以在軸向(下面稱為z方向)上進行位置確定。軸向在此系指在成像鏡頭的光軸上的方向，即光的主要傳播方向。

三維的定位由所謂的“粒子追蹤”實驗已知，比如在Kajo等人，1994，Biophysical Journal，67、Holtzer等人，2007，Applied Physics Letters，90和Toprak等人，2007，Nano Letters，7(7)中有所記載。所述定位也已經應用在圖像產生方法中，這些方法基于上述對單分子的切換和定位。為此參見Huang等人，2008，Science，319和Juette等人，2008，Nature Methods。對于現有技術，還參見Pavani等人，2009，PNAS，106。

在z方向上對點狀樣本的定位在原則上可以采用如下方式來進行：對在攝像機的探測面上檢測到的光斑的變化加以分析，當點狀樣本從在光學方面變成探測面的清晰平面或聚焦平面移出時就能看到這種變化。在此，點狀樣本在下文中系指一種樣本，其尺寸小于成像鏡頭特別是探測物鏡的由衍射引起的分辨率極限。在這種情況下，探測物鏡使得這種樣本以三維聚焦光分布的形式在圖像空間中成像。該聚焦光分布在攝像機的探測面上產生光斑，該光斑通過所謂的“點擴散函數”即點成像函數或簡寫為PSF來表征。如果現在點狀樣本在通過焦點的z方向上即垂直于清晰平面移動，PSF的大小和形狀就會改變。如果在PSF的大小和形狀方面分析與所檢測的光斑相應的探測信號，就能由此推斷出樣本的實際z位置。

如果點狀樣本離開清晰平面太遠，在攝像機的探測面上產生的光斑就會模糊不清，從而在通常的測量噪聲內無法再感知到相應的測量信號。因而在樣本空間內在z方向上有個圍繞中央的聚焦平面或清晰平面的區域，在這個區域內，點狀樣本在探測面上產生光斑，該光斑仍足夠清晰，以便能夠被利用來在z方向上定位點狀樣本。在z方向上的含有清晰平面的這個區域在下文中稱為“清晰深度區域”。

然而在三維定位時存在一個基本問題：由點狀樣本引起的PSF關于探測面是對稱的。這意味著，雖然在點狀樣本從清晰平面中移出時PSF發生改變，從而可以確定點狀樣本相距清晰平面的間距，但是，PSF的變化在清晰平面的兩側是對稱的，因而無法判定點狀樣本在清晰深度區域內處于清晰平面的哪一側。

已知有各種不同的可以用來解決上述問題的方法。這些方法在本領域內例如有“Astigmatismusverfahren(散光法)”(上述文獻Kajo等，Holtzer等人和Huang等人)、“Bi-Plane-Verfahren(雙平面法)”(參見Toprak等和Juette等)和“Doppelhelixverfahren(雙螺旋法)”(參見Pavani等)。這些方法的共同點是，為了在z方向上定位點狀樣本，對在探測器上產生的光斑加以分析，以便確定特征參數，并給該特征參數指配點狀樣本的z位置。這種指配借助于事先確定的指配信息來進行，所述指配信息使得特征參數與點狀樣本的z位置相關。作為特征參數，比如在散光法中考慮能表征光斑形狀的參數，或者，比如在雙平面方法的情況下，考慮能使得兩個光斑的延展距離彼此相關的參數，這些光斑來自于同一個光斑且由探測面產生，這些光斑的指配的清晰平面在樣本空間內在z方向上彼此錯開。

現在問題在于，在真正的光學顯微測量之前確定的指配信息往往不準確，因而無法準確地確定z位置，所述指配信息能實現在測量中求取的特征參數與點狀樣本的軸向z位置之間的指配。指配信息因而與試樣的光學特性的變化有關。對于定位顯微術中所需要的大功率鏡頭而言，光學特性的微小變化就已經導致成像錯誤，例如導致球形的像差。這造成由光斑產生的PSF的形狀發生改變，例如以校準曲線形式求取的指配信息因而對于新的光學條件來說不再正確。在這種情況下，給在探測器上檢測到的光斑指配錯誤的z位置。

對于使用者來說，往往難以在最終要予以測量的生物試樣中施加能用來產生上述校準曲線的校準件，比如發熒光的小球。尤其是當這些校準件為了避免因色像差所致的錯誤而要以不同的顏色發熒光時就是這種情況。因此，在實踐中優選的方案是，以自己的校準試樣進行校準，即確定指配信息。然而在這里，錯誤校準的問題有很大影響，因為校準試樣的光學特性從來都不與真正的測量試樣的光學特性一致。蓋片玻璃厚度方面的微小差異或者試樣嵌入介質方面的微小差異就已經會導致校準曲線形狀的顯著偏差。

即使直接在要測量的試樣中以巨大的試驗代價開設出校準試樣，如此得到的校準曲線也可能有誤。因此，微小的溫度變化例如就已經導致通常的浸漬油改變其折射系數，這又 造成在成像中出現球形的像差。因而即使在同一個試樣中也可能在校準試樣攝取時間點與真正的測量的時間點之間出現校準曲線變化。此外，用作校準試樣的一定大小的熒光小球的信號始終不同于形成點狀樣本的單分子的信號，這又導致了有錯誤的校準曲線。

在實踐中，這些問題導致往往無法絕對精確地確定點狀樣本的z位置。因此，雖然完全可以確定z位置方面的相對差異，進而也能以高的分辨率區分開相鄰的結構，但難以判斷可能的相鄰的結構相互間的距離到底有多遠。在此重要的是，在分辨率與絕對的位置確定之間進行區分，所述分辨率即為將緊密相鄰的結構彼此分開的可能性。因此，現有技術中所采用的例如校準曲線形式的指配信息雖然通常能實現所希望的分辨率，卻無法精確地確定點狀樣本的絕對的z位置。這種情況也可以稱為三維圖像在z方向上嚴重的(通常為非線性的)失真，這種失真由光學像差引起。恰恰在現代生物學中，這是個很大的問題。因此，例如蛋白質(Protein)的確切形態及布置方式顯著地影響著其工作方式。因此，為了得到關于結構布置的信息，轉而要在全部的三個空間方向上都進行精確的且絕對的測量。而在現有技術中存在的用于在z方向上定位的不足的校準方案無法允許實現足夠的可靠性。

技術實現要素：

本實用新型的目的因此是，對開篇所述類型的用于定位點狀樣本的光學顯微方法加以改進，從而可以在z方向上相比于目前更為精確地定位點狀樣本。

本實用新型揭示了一種用于定位試樣中的點狀樣本的光學顯微機構，帶有：成像鏡頭，其在樣本空間中沿著其光軸(O)具有預定軸向延展距離(t)的清晰深度區域；探測器，成像鏡頭把設置在樣本空間內的試樣成像到該探測器上；和控制單元，該控制單元在清晰深度區域內部對試樣中含有的點樣樣本予以定位，其方式為，成像鏡頭在探測器上產生第一試樣圖像，該控制單元分析該第一試樣圖像；其中，為了在光軸(O)的方向上定位相應的點狀試樣，控制單元求取第一試樣圖像的表示點狀樣本的光斑的特征參數(d)，并根據預定的指配信息給該特征參數指配涉及點狀樣本的軸向的z位置，其特征在于，在清晰深度區域內對點狀樣本進行定位，受控制單元控制的移調單元使得該清晰深度區域在樣本空間內相對于試樣沿著光軸(O)移動預定的軸向移調路程，該移調路程小于清晰深度區域的軸向延展距離(t)；在清晰深度區域軸向地移動時，成像鏡頭使得試樣重新成像到探測器上，并產生第二試樣圖像；控制單元在該第二試樣圖像中根據預定的軸向移調路程來求取點狀樣本的z位置；控制單元把點狀樣本的在第一試樣圖像中求取的z位置與同一點狀樣本的在第二試樣圖像中求取的z位置相比較；控制單元根據這種比較來產生矯正信息，控制單元借助于該矯正信息對點狀樣本的根據指配信息求取的z位置予以矯正。，

本實用新型實現該目的的方式為，在清晰深度區域內對點狀樣本進行定位，該清晰深 度區域在樣本空間內相對于試樣沿著光軸移動預定的軸向移調路程，該移調路程小于清晰深度區域的軸向延展距離；在清晰深度區域軸向地移動時，試樣借助于成像鏡頭重新成像到探測器上，并產生至少一個第二試樣圖像；在該第二試樣圖像中根據預定的軸向移調路程來求取點狀樣本的z位置；把點狀樣本的在第一試樣圖像中求取的z位置與同一點狀樣本的在第二試樣圖像中求取的z位置相比較；根據這種比較來產生矯正信息，借助于該矯正信息對點狀樣本的根據指配信息求取的z位置予以矯正。

如開篇已述，根據本實用新型的在樣本空間內的清晰深度區域系指在z方向上的在中央的聚焦平面或清晰平面周圍的區域，在該區域內部，點狀樣本在探測器上產生一個光斑，該光斑仍足夠清晰，以便能夠被利用來在z方向上定位點狀樣本。在此無需完全用盡 該最大可能的清晰深度區域。因而可以有利地根據所希望的定位精度來有意識地縮小清晰深度區域，進而可以從分析中提取出已經很模糊不清的但本身仍可利用的光斑。

本實用新型的方案規定，在測量期間對可能由于光學成像錯誤所致的有誤的指配信息予以矯正，所述指配信息例如以存儲的校準函數的形式存在。為此使得成像鏡頭的清晰深度區域相對于試樣移動一段軸向的移調路程，所述清晰深度區域的沿著光軸的軸向延展距離是已知的，所述移調路程小于清晰深度區域的軸向延展距離。換句話說，這種移動適當地進行，從而在樣本空間內在最初的清晰深度區域與移動了的清晰深度區域之間沿著光軸存在一定的重疊。

這種重疊因而按下述方式實現：清晰深度區域沿著光軸移動的軸向移調路程小于清晰深度區域的軸向延展距離。因此，該移調路程例如處于清晰深度區域的軸向延展距離的5％-90％、10％-80％、15％-70％、20％-60％或25％-50％的范圍內。不言而喻，這些值范圍僅僅是示范性的。

根據本實用新型，使得清晰深度區域移動一段小于清晰深度區域的軸向延展距離的軸向移調路程，這應理解為，所考察的兩個清晰深度區域即最初的清晰深度區域和移動了的清晰深度區域沿著光軸有重疊。這意味著，本實用新型也覆蓋清晰深度區域的移動的一組步驟，按照該組步驟，在一個單獨的步驟中，清晰深度區域移動一段大于清晰深度區域的延展距離的移調路程，只要該組步驟在總體上導致在所考察的清晰深度區域之間實現前述的軸向重疊。

清晰深度區域以一個或多個步驟在樣本空間內移動的軸向移調路程小于清晰深度區域的軸向延展距離，這種情況意味著，清晰深度區域在z方向上的移動以一精度進行，該精度超過成像鏡頭的在z方向上的分辨率精度。這例如可以通過一種壓電執行器來實現，該壓電執行器要么使得成像鏡頭要么使得試樣在z方向上移動。同樣可行的是，為了移動清 晰深度區域，使用合適的光學器件，例如可變形的透鏡、可變形的或可移動的反射鏡或立體的光調制器。

根據本實用新型的矯正能實現超出清晰深度區域進行三維的顯微成像，這在以前由于圖像在z方向上失真而無法直截了當地實現。雖然在原則上即使針對通常的方法也可考慮在攝取一個圖像之后使得該圖像在z方向上精確地移動一個與清晰深度區域的軸向延展距離相等的量值，然后攝取另一個圖像，以便最后把這兩個圖像在z方向上組合起來，這樣就可得到一個在z方向上延伸經過兩個清晰深度區域的總圖像，但這種做法卻要求在z方向上以一精度對點狀樣本進行定位，而該精度在以前是無法達到的。采用本實用新型的方法實現的精度才允許在z方向上把多個圖像組合起來，而不會在圖像之間出現錯誤的重疊或空隙。

如果用來矯正點狀樣本的z位置的矯正信息以矯正規則的形式被提供，根據本實用新型采用該矯正規則給點狀樣本的利用最初的(錯誤的)指配信息求取的z位置指配經矯正的z位置，那么，有時在前述情況下為每個在z方向上相繼的清晰深度區域都要求取一個自己的矯正規則，并應用于在該清晰深度區域中對點狀樣本定位。

本實用新型的方法尤其在如下情況下可得到卓有成效的應用：校準曲線可通過試樣或經過試樣的光路的光學特性的變化而改變。因而可以有不同的校準適用于試樣的不同的區域。這樣的例子有浸在水狀介質中的試樣。成像的清晰深度區域浸入到試樣中越深，光就必須穿過越多的水，水具有不同于其它光學材料比如浸漬油和玻璃的折射系數。因此，光學圖像進而校準曲線也根據清晰深度區域的z位置而改變。

根據本實用新型，第一或第二試樣圖像分別是圖像數據組，該圖像數據組例如通過開篇所述的原初數據-單圖像來實現。

優選在清晰深度區域內部沿著光軸規定至少一個相對于清晰深度區域偏移的z偏差位置。由至少一個在清晰深度區域軸向移動后在探測器上產生的第二試樣圖像構成一些光斑，這些光斑形成了在軸向移動的清晰深度區域中布置在z參考位置的點狀樣本，把所述光斑中的至少一個規定為參考光斑。用參考光斑表示的點狀樣本的z位置在樣本空間內根據清晰深度區域的軸向移調路程和z參考位置來確定。第一試樣圖像形成了與第二試樣圖像的參考光斑相同的點狀樣本，由該第一試樣圖像構成的光斑之一被確定為比較光斑。根據由比較光斑形成的點狀樣本的z位置相對于由參考光斑形成的同一點狀樣本的z位置的偏差，產生矯正信息，利用該矯正信息來矯正點狀樣本的根據指配信息求取的z位置。

因而在清晰深度區域內部規定了至少一個相對于清晰深度區域偏移的z參考位置。后者意味著，z參考位置與清晰深度區域一樣地在樣本空間內移動。例如可以把清晰深度區域的在樣本空間內的軸向上邊界或軸向下邊界規定為z參考位置。清晰深度區域的中央的清 晰平面所在的z位置也適宜作為z參考位置。此外可行的是，在清晰深度區域內部并非僅規定一個唯一的z參考位置，而是規定多個z參考位置，它們在樣本空間內的位置是已知的，因而能實現無誤地確定位于z參考位置的點狀樣本的z位置。

該實施方式因而規定，清晰深度區域的不受光學成像錯誤影響的精確的移動被利用來在當前測量期間例如以一定的時間間隔在試樣中進行參考測量，借助于這些參考測量可以對錯誤的校準予以矯正。這種矯正的依據是，在清晰深度區域軸向地移動后攝取的試樣圖像中，可以無誤地確定在移動了的清晰深度區域內部位于z參考位置的那些點狀樣本，因為所述z參考位置是已知的。根據本實用新型，在知道這些正確的z位置情況下，可以產生矯正信息，所述矯正信息于是可以用來在清晰深度區域移動之前攝取的試樣圖像中對點狀樣本的在該試樣圖像內求取的z位置予以矯正。如果通過清晰深度區域的連續移動使得矯正信息逐漸完善，就可以采用這種方式對整個圖像的因錯誤的校準引起的失真予以矯正。

優選使得清晰深度區域按多個步驟軸向地移動。于是在這些步驟的任一步驟中都借助相應的參考光斑和相應的比較光斑來產生矯正信息。最后，借助逐步地產生的矯正信息對點狀樣本的根據指配信息求取的z位置予以矯正。通過清晰深度區域的逐步移動，最初的即未移動的清晰深度區域同z參考位置一起被掃描。由于z參考位置在每一步驟中都是已知的，所以可以在最初的清晰深度區域內部，對在與分別移動的z參考位置重疊的z位置上確定的那些點狀樣本予以精確定位。于是基于這些精確地確定的z位置，借助矯正信息也可以求取在最初的清晰深度區域內部的位于這些位置之間的z位置。

優選在每個步驟中都用針對相應的參考光斑求取的z位置來代替根據指配信息針對相應的比較光斑求取的z位置，并通過這種代替來產生形成矯正信息的矯正函數。在此，該矯正函數優選覆蓋已用來攝取第一試樣圖像的整個清晰深度區域。

按照一種特別優選的設計，通過插值法來求取矯正函數的中間值，對于這些中間值來說，通過清晰深度區域的逐步移動并無比較光斑和參考光斑可供使用。在這種情況下，通過z參考位置的移動精確地求取的z位置形成了取值點，基于這些取值點可以進行插值，例如進行簡單的樣條插值。因而例如選擇合適的對通常的校準錯誤予以考慮的模型函數，該模型函數與前述取值點適配，以便得到所希望的矯正函數。

點狀樣本的通過清晰深度區域的逐步移動求取的z位置優選重疊成總的定位圖像。因此，(第二)試樣圖像并非僅僅用來矯正在最初的(第一)試樣圖像中求取的z位置，而且用來產生總的定位圖像，其在z方向上延伸經過比最初的清晰深度區域大的區域。

清晰深度區域在樣本空間內移動的軸向移調路程優選借助于傳感器來檢測。由此確保在對點狀樣本的所求取的z位置進行矯正中予以考慮的軸向移調路程始終都精確地已知。清晰深度區域相對于試樣的移動可以按下述方式進行：要么使得試樣相對于成像鏡頭要么 使得成像鏡頭相對于試樣沿著光軸移動。但本實用新型并不局限于此。因而例如也可以使用可變形的透鏡、可變形的反射鏡、立體的光調制器等，以便使得清晰深度區域在樣本空間內沿著成像鏡頭的光軸移動。

在一種特殊的實施方式中，使用一種置于探測器之前的柱形透鏡，該柱形透鏡導致在探測器上產生的光斑的可區分的形狀變化，如果指配于該光斑的點狀樣本沿著光軸從位于清晰深度區域內的清晰平面的一側移動至其另一側。光斑的形狀變化于是可以用作在z方向上進行定位之用的特征參數。

這里需要指出，術語“光斑的形狀”根據本實用新型系指，它不僅具有單光斑的形狀，而且包括由多個光斑構成的整體的形狀，這種整體比如在開篇所述的雙螺旋方法中提到過。在那里例如考察了兩個光斑，這些光斑同樣進行相互間的相對旋轉運動。

通過比較光斑形成的比較結構優選在考慮其亮度的情況下來確定，即在考慮有助于該結構的單光斑總數的情況下確定。該實施方式尤其是當在清晰深度區域移動時求取的z位置不僅用于矯正事先借助指配信息確定的z位置，而且被考慮用于產生總的定位圖像時是有利的。通過該改進方案來避免在總的定位圖像中有干擾性的亮度差異。

指配信息的獲取方式例如可以為，使得校準點狀樣本在清晰深度區域內部沿著光軸移動，并根據校準點狀樣本的z位置來檢測在探測器上產生的校準圖像的形成校準點狀樣本的光斑的特征參數。作為所述特征參數，例如考慮采用探測器上的光斑的形狀和/或延展距離。

為了實施本實用新型的方法，根據權利要求14，規定了一種用于定位試樣中的點狀樣本的光學顯微機構。

附圖說明

下面參照附圖詳述本實用新型。其中：

圖1為示意圖，其示出用于在z方向上定位點狀樣本的一個實施方式；

圖2為示意圖，其示出用于在z方向上定位點狀樣本的一個替代的實施方式；

圖3示出一種指配規則，按照該規則，參照點狀樣本相對于清晰平面的z位置來放置在探測面上檢測到的光斑的形狀；

圖4為示意圖，在該圖中示出了根據本實用新型所使用的清晰深度區域；

圖5為示意圖，其示出在z方向上因錯誤的指配信息引起的試樣圖像失真；

圖6為示意圖，其示出如何通過清晰深度區域的根據本實用新型發生的移位來矯正點狀樣本的z位置；和

圖7為曲線圖，其示范性地示出采用根據圖6的方法產生的矯正函數。

具體實施方式

首先參照圖1-3介紹兩個實施方式，在這些實施方式中以不同的方式求取特征參數，所述特征參數允許在z方向上定位點狀樣本。

圖1示出一種光學顯微機構10，其帶有作為圖像鏡頭的物鏡12和探測面14。根據圖1的裝置具有兩個分開的探測通道，在這些探測通道中，圖1中左邊的那個通道主要由物鏡12和第一筒狀透鏡16構成，而圖1中右邊的那個通道則由物鏡12和第二筒狀透鏡18構成。來自點狀樣本20的光以相同的部分被射線分配器22以及換向鏡24、26和28引到兩個探測通道中。

兩個探測通道在其聚焦位置方面略有不同。這意味著，第一探測通道具有在光學方面變成(konjugieren)第一清晰平面32的第一圖像面30，而另一探測通道具有在平行于物鏡12的光軸O的方向上即在z方向上相對于第一圖像面30錯開的第二圖像面34，該第二圖像面在光學方面變成也在z方向上相對于第一清晰平面32錯開的第二清晰平面36。

如果要定位的點狀樣本20位于一個探測通道的清晰面上，它就被物鏡12在那里清晰地成像，而它在另一探測通道中被不清晰地成像。如果它位于兩個清晰平面32和36之間，它就會在兩個探測通道中被不清晰地成像。

前述情況在圖1中通過光斑38、40、42和44來表示，這些光斑根據點狀樣本20相對于清晰平面32和36的z位置在探測面14上產生。光斑38、40、42和44在圖1中因而在x-y平面的俯視圖中示出。光斑38、40、42和44分別用PSF來表征，PSF由通過物鏡12產生的在探測面14上的聚焦光分布而得到。

如果點狀樣本20位于第一清晰平面32上，就在探測面14上在左邊的探測通道中得到比較小的光斑38，而在右邊的探測通道中得到相比之下較大的光斑42。而若點狀樣本20布置在清晰平面36中，就在探測面14上在左邊的探測通道中得到較大的光斑40，而在右邊的探測通道中得到較小的光斑44。

于是可以由在探測面14上產生的光斑38、40、42和44導出一個特征參數，該特征參數是點狀樣本20相對于清晰平面32和36的z位置的量度。作為該特征參數，例如可以使得在左邊的探測通道中產生的光斑38或44的延展距離與在右邊的探測通道中產生的光斑42或44的延展距離按比例相比。

圖2示出了一種實施方式，在該實施方式中采用其它方式檢測前述特征參數，該特征參數能實現求取點狀樣本的z位置。在此，圖2首先在部分圖a)中示出了通常的設置情況，按照這種設置，點狀樣本20利用由物鏡透鏡50和筒狀透鏡52構成的成像鏡頭54被成像到探測面56上。在這里，點狀樣本20將位于清晰平面58上，該清晰平面就是在光學方面 變成探測面56的面。

成像鏡頭54使得來自點狀樣本20的光形成為投射到探測面56上的三維的聚焦光分布。探測面56因而檢測到一個光斑60，這個光斑是所述聚焦光分布的垂直于z方向的平面的剖切面。為了更清楚地示出這種情況，在圖2中以探測面56的俯視圖即在x-y平面上示出了該光斑60。

在圖2的部分圖a)中所示的情況下，點狀樣本20位于清晰平面58上，探測面56上的光斑60具有圓形的形狀，即一種關于在x-z平面和y-z平面上的鏡面對稱的形狀。

圖2在部分圖b)中示出了根據本實用新型的一種變型設計，按照這種設計，除了物鏡50和筒狀透鏡52外，還設置了柱狀透鏡62。柱狀透鏡62具有在x方向和y方向上不同的折射力，因而對于x方向和y方向來說具有不同的聚焦位置。相應地，探測面56上的光斑60在x方向和y方向上呈十字形地變形。點狀樣本20在部分圖b)中恰好位于現在不同的兩個清晰平面的中間，其中，該中間位置也標有58。但十字形的光斑60卻保持在前述意義下的對稱。

據圖2在部分圖c)中所示的情況，點狀樣本20布置在清晰平面58的上方。從清晰平面58錯開導致了探測面56上的光斑60非對稱地變形為一個橢圓。在此，點狀樣本20離開清晰平面58越遠，光斑60的橢圓形狀就越明顯。

在圖2于部分圖d)中所示的情況下，點狀樣本20位于清晰平面58的下方。在這里，探測面56上的光斑60也橢圓形地變形，然而是在與部分圖c)中的光斑60的方向不同的方向上變形。因此，借助光斑60的形狀可以辨別出點狀樣本20布置在清晰平面40的上方還是下方。如由根據圖2的視圖可見，可以借助探測面56上的光斑60的形狀和延展距離來確定點狀樣本20相對于清晰平面58的z位置。這在當前設計中借助例如在圖3中示出的指配規則來實現。這種指配規則可以通過校準測量來得到，在這些校準測量中，有個校準-點狀樣本沿著z方向從清晰平面58的一側移至其另一側，并在這種情況下針對現在已知的z位置來確定光斑的形狀。這樣就得到了指配規則，其能實現在以后測量時給測得的光斑指配正確的z位置。在實踐中，為此使用一種專用的校準試樣，例如一種帶有發熒光的小球或者帶有被照明的且散射性的納米微粒作為校準點狀樣本。

圖3示出了一種按照上述設計建立起來的指配規則。這里把光斑在x方向上的標有s_x的延展距離與光斑PSF在y方向上的標有s_y的延展距離的差規定為特征參數d。這樣就得到了一種指配規則d(z)，該規則能實現在真正的圖像攝取時針對測得的每個光斑都確定一個z位置。這個位置然后與x-y位置一起存儲起來，且供產生高分辨率的三維圖像使用。

對可以用來檢測點狀樣本的z位置的指配規則的確定并不局限于上述實施方式。因而例如開篇所述的雙螺旋法也適合于產生這種指配規則。

還要指出，圖3中所示功能形式的指配規則僅僅是一種示范性的設計。因而例如也可以采用在測得的PSF與事先存儲的或計算的PSF之間的關系的形式來進行圖像比較。與測得的PSF具有最大的相似性的所存儲的或計算的PSF的z位置于是被視為正確的z位置。如果測得的PSF在其形狀方面并不與所存儲的或計算的PSF之一一致，則可以例如通過插值法給它指配一個z位置，這個位置位于所存儲的或計算的PSF的與測得的PSF最相似的z位置之間。

下面參照圖4-7示范性地介紹如何能夠根據本實用新型基于前述類型的指配規則來矯正對點狀樣本的定位。

圖4以純示意性的視圖示出根據本實用新型的顯微機構的一個實施例，其中，在圖4中僅僅示出了用來介紹本實用新型的矯正方法的那些組件。在圖4中尤其省去了探測器。

在根據圖4的設置中，物鏡70通過浸漬介質78將安置在蓋片玻璃72上的試樣76成像到探測器上。物鏡70具有一個清晰深度區域78，該區域沿著物鏡70的光軸O即在z方向上具有軸向的延展距離t。清晰深度區域78是這樣確定的：位于清晰深度區域78內部的點狀樣本被物鏡70以光斑的形式成像到探測器上，其清晰度足以例如在考慮圖3中所示類型的指配規則情況下能實現在z方向上進行定位。清晰深度區域78在樣本空間內的位置和延展距離因而被預先確定且是已知的。

根據圖4的機構還包括控制單元80，該控制單元對機構的全部運行加以控制。控制單元80尤其具有計算元件，該計算元件進行對于定位點狀樣本所需要的計算和分析。控制單元80還控制著壓電執行器82，利用該壓電執行器可以使得物鏡70沿著光軸O移動，以便使得清晰深度區域78按規定的方式沿著光軸O移動。物鏡70進而清晰深度區域78在樣本空間內移動一段移調路程，與控制單元80耦接的傳感器84檢測這段移調路程。

試樣76含有各種不同的結構90、92、94、96和98，這些結構在清晰深度區域78中布置在不同的z位置上。這些結構90、92、94、96和98帶有標記，所述標記形成了要定位的點狀樣本。在攝像期間，位于結構90、92、94、96和98中的那些標記分別單獨地作為光斑成像到探測器上，這些光斑在其位置和形狀方面被控制單元80分析。通過這種方式將產生在z方向上高分辨率的圖像。

在圖5的視圖中示出了錯誤的指配規則是如何導致圖像在z方向上失真的。因而在圖5的左邊部分中示出了帶有清晰深度區域78的樣本空間，在該樣本空間中布置著所述結構90、92、94、96和98，而在圖5的右邊部分中示出了這些結構在該圖像空間內的成像。在圖像空間內的與樣本空間的z位置相應的z位置標有符合“′”。

在根據圖5的例子中，錯誤的指配規則導致了圖像在z′方向上壓縮。

在圖6中示出因錯誤的指配規則引起的這種圖像壓縮是如何被逐漸消除的，其方式為， 使得清晰深度區域78分多個步驟在z方向上移動。在此，圖6的部分圖a)相應于圖5中所示的情況。

首先在清晰深度區域78中規定一個z參考位置，這個參考位置相對于清晰深度區域78是位置固定的，也就是說，與清晰深度區域78一起在樣本空間內移動。在當前例子中，清晰深度區域78的標有z_s的下面的邊界被確定為z參考位置。由于該z參考位置是已知的，所以可以準確無誤地檢測位于z參考位置的結構在試樣內的z位置。這種情況在圖6的部分圖a)中適用于結構90，在該部分圖中，清晰深度區域78尚未移動。

如果現在將試樣成像到探測器上，并隨后使得清晰深度區域78連同其z參考位置移動至位置z_s＝z₁，就會得到在圖6的部分圖b)中示出的情況。在那里，結構92位于清晰深度區域78的z參考位置。對于布置在z參考位置的結構92所含有的那些點狀樣本來說，現在可以準確地確定z位置。由布置在z參考位置的點狀樣本在探測器上產生的光斑在下面稱為參考光斑。現在，借助這些參考光斑，在先前攝取的第一試樣圖像(圖6的部分圖a)中確定出與在清晰深度區域78移動后攝取的第二試樣圖像的參考光斑相應的光斑。在第一試樣圖像中含有的這些光斑在下面稱為比較光斑。

如對圖6的部分圖a)和b)的比較所示，在第一試樣圖像內，由于指配規則錯誤，在結構92中含有的點狀樣本的z位置是錯誤的，即已用一個太小的值z_x′求取。這個錯誤的值現在可以用在第二試樣圖像內被正確地求取的值來代替，并因而予以矯正。該正確的值已知為z₁＝z₁′。

如圖7中所示，現在可以在曲線上參照錯誤的位置z_x′，即針對結構92在第一試樣圖像、部分圖a)中已找到的位置，繪出結構92的正確的位置z₁。

現在使得清晰深度區域78又移動一段規定的移調路程，這段移調路程小于清晰深度區域78的軸向的延展距離t。相同長度的各個軸向移調路程的總和基本上等于清晰深度區域(78)的軸向延展距離。在這個例子中，在第二移動步驟中規定的移調路程又等于量值D_z，從而z參考位置移動至位置z₂。同樣攝取試樣圖像，也要考察布置在z參考位置即布置在清晰深度區域78的下邊界處的結構。根據圖6的部分圖c)，這在當前就是結構94，該結構的在探測器上的點狀樣本產生了相關的參考斑點。借助于這些參考斑點又在第一試樣圖像(圖6的部分圖a)中確定出相關的比較光斑，也就是說，在第一試樣圖像中搜尋結構94。在第一試樣圖像中給結構94指配z位置z₊′。在根據圖7的曲線上，參照該位置z₊′繪出正確的位置z₂。

采用前述方式以適當數量的步驟進行操作，如圖6中部分圖d)和e)所示，直到覆蓋在圖6的部分圖a)中示出的整個最初的清晰深度區域。

對于在第一試樣圖像中已再次找到的全部結構來說，現在可以借助根據圖7的曲線在 縱坐標上讀出正確的位置。基于所示的測量點，可以借助于合適的對通常的校準錯誤予以考慮的模型函數來得到矯正規則。也可以有選擇地采用簡單的樣條插值法或其它類型的插值法，以便得到矯正規則。圖7中標有c(z′)的該矯正規則現在可以用來矯正第一試樣圖像(圖6的部分圖a)。由此針對在第一試樣圖像中求取的全部位置z′根據矯正規則c(z′)得到各自正確的z位置。

需要指出，前述方法純粹是示范性的。不言而喻，也可以采用不同于所述的其它算法。尤其在實踐應用中可以并非僅僅確定在清晰深度區域內的一個唯一的位置固定的z參考位置，比如在圖4-7中所示的例子就是這種情況。因而可以在清晰深度區域的其它位置規定其它z參考位置。

也可以考慮的是，不僅考察第n個圖像相對于第一個試樣圖像的偏差，而且獲取第n個圖像的結構相對于第m個圖像的結構的位置偏差，其中，n和m是等于或大于1的自然數。這樣就得到了更多的測量點，從而可以得到更精確的矯正規則。也可以采用直接確定與在第m個圖像中同樣出現的結構相比而言第n個圖像的失真的圖像處理算法。重要的僅僅是，通過清晰深度區域的非常準確的移動，得到關于所考察的結構的z位置的附加信息，該信息用于定位點狀樣本。

也可以在樣本空間和圖像空間內部靈活地調整z或z′的值范圍，即調整清晰深度區域和相應的圖像區域，如果矯正規則不能應用于相應的整個試樣區域。

此外也可行的是，利用移動的清晰深度區域已得到的位置信息不僅用于矯正在第一試樣圖像中得到的z位置，而且可以在圖像產生本身中考慮該位置信息。