一種改性滌綸材料的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種應用于血液接觸的涂絕材料的制備方法，具體設及一種表面引入 具有親水性和負電荷多膚的涂絕材料的制備方法。
【背景技術】
[0002] 我國每年因屯、腦血管疾病死亡的人數有數百萬，約W30%的比例逐年增加，因此， 血管移植已成為關注的熱點。人造血管是目前臨床上最為緊缺的醫療器械，其中小口徑人 工血管的移植還是臨床空白，即便是中、大口徑人工血管，在我國產品也非常稀少，國產產 品每年的使用比例非常小，只有20%左右。保守估計，全球每年超過200萬（約60萬人小 口徑），我國每年約百萬患者需要進行血管移植，所W研制具有自主知識產權的新型人工血 管材料尤其重要。
[0003] 目前，人工血管使用的原料主要為涂絕和聚四氣乙締運兩種合成高分子材料，由 涂絕值acron)纖維織成的管狀人工血管己應用于臨床，如治療主動脈瘤、主動脈狹窄等， 成功用于大血管置換。另一種國內外臨床上應用廣泛的大口徑人工血管由合成高分子聚四 氣乙締為原料經注塑而成的，也被成功用于大血管置換。但運兩種材料疏水性都很強，不利 于管內壁內皮化，組織相容性較差，有排異現象，易誘發血栓、表面沉積及炎癥，為了能夠較 長時間的防止血栓，患者還須終身服藥，5年后的通楊率約只有一半左右。由此可見，純的涂 絕和聚四氣乙締并不是最理想的人工血管材料，尤其不適用于臨床上空白的小口徑人工血 管的研制。
[0004] 如今，一些研究報導了用絲素蛋白溶液浸潰涂層多孔針織涂絕血管來減輕對異物 的反應和促進內皮細胞粘附，W及降低織物的滲水率（如中國協和醫科大學博±學位論 文：絲素蛋白涂層人工血管的研制）。為了提高聚四氣乙締材料人工血管的內皮化，將骨髓 CD34+細胞種植于人工血管先行內皮化后，再用于移植來改善通楊率（骨髓CD34+細胞人工 血管內皮化實驗研究，中華外殼雜志，2004)。也有將血管內皮生長因子（VEG巧基因裝載于 聚四氣乙締材料中來促進內皮細胞的生長（聚四氣乙締人工血管材料作為VEGF基因載體 的可行性研究，浙江大學學報，2007)。另外在抗凝血性能方面，報導了肝素固化和共價水賠 素W提高抗凝和通楊性。
[0005] 絲素蛋白或者膠原蛋白涂層可W改善一定的細胞相容性，但對于血管移植物而 言，一定的親水性是組織得W修復非常重要的因素；另外，天然血管內壁為一層負電荷內 膜，有利于保護血液細胞和防止血栓形成，人工血管也應該具有類似于天然血管的負電性 膜層。而絲素蛋白或者膠原蛋白涂層對運些特性的改善是不穩定的，因為絲素蛋白或者膠 原蛋白溶液是一種分子量分布很廣的混合溶液，接枝上去的成分不是單一的多膚或蛋白分 子，有的不一定具有較好親水作用或電負性，加上接枝效率往往較低，不會得到凸顯優異親 水性和負電性的表面。
【發明內容】
[0006] 針對目前涂絕大口徑人工血管的臨床問題和不能應用于小口徑人工血管制備的 根本問題，本發明旨在提供一種通過生物表達的多膚及其修飾的改性涂絕材料的制備方 法，制備出的改性涂絕屬于血液相容性材料，具有優異的表面親水性和負電荷性，可W制備 應用于與血液直接接觸的植入物（如人工血管、屯、臟修補片、人工屯、臟瓣膜等），有利于組 織愈合和抗凝固。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明通過W下技術方案實現：
[0008] 一種改性涂絕材料的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟1)設計并構建攜帶有具有親水性和負電荷多膚的基因的原核系統表達載體 (JournalofDon曲uaUniversity巧nglishEdition), 2012, 29:26-29);所述具有親水性 和負電荷多膚來自于生物體表達，為第一多膚FI、第二多膚F4或第Ξ多膚F8中的一種，其 多膚序列均來自于家蠶絲素蛋白中的一段類似物及其重復；所述第一多膚F1的氨基酸序 列如SE化ID.NO. 1，所述第二多膚F4的氨基酸序列如SE化ID.NO. 2,所述第S多膚F8的氨 基酸序列如沈化ID.NO. 3 ;
[0010] 步驟2)將已經構建好的攜帶有第一多膚FI、第二多膚F4或第Ξ多膚F8基因的原 核系統表達載體轉染大腸桿菌度L21)細胞，用Luria-Bertani培養基經異丙基-β-D-硫 代半乳糖巧誘導培養數小時；
[0011] 步驟3)收集并破碎上述大腸桿菌細胞，再經過純化，獲得具有親水性和帶強負電 性的第一多膚F1、第二多膚F4或第Ξ多膚F8,并配制成一定濃度的功能多膚水溶液；
[0012] 步驟4)將涂絕經氨氧化鋼處理后用去離子水清洗，再浸入上述功能多膚水溶液 中，加入交聯劑4°C過夜反應，即得改性涂絕材料。
[0013] 與現有技術相比，本發明具有W下有益效果：
[0014] 本發明提供了一種通過生物表達多膚修飾的改性涂絕材料的制備方法，該方法中 所設及的多膚鏈側基含有大量的親水性基團，多膚來自于生物體表達，序列來自于天然蛋 白質的類似物，無毒無刺激性，分子量單一，能與涂絕共價結合，持續穩定地賦予涂絕親水 性能和負電性。本發明制備出的改性涂絕屬于血液相容性材料，具有優異的表面親水性和 負電荷性，可W制備應用于與血液直接接觸的植入物（如人工血管、屯、臟修補片、人工屯、臟 瓣膜等），能夠降低對細胞的傷害，利于內皮化，阻止蛋白沉積和血細胞聚集而造成血栓堵 塞，有利于組織愈合和抗凝固。
[0015] 上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 并可依照說明書的內容予W實施，W下W本發明的較佳實施例詳細說明如后。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結合實施例，來詳細說明本發明。
[0017] 一種改性涂絕材料的制備方法，可W通過如下實施例實施。在制備所述改性涂絕 材料之前，應先設計并構建攜帶有具有親水性和負電荷多膚的基因的原核系統表達載體 (JournalofDon曲uaUniversity巧nglishEdition), 2012, 29:26-29);所述具有親水性 和負電荷多膚來自于生物體表達，可W為第一多膚FI(其氨基酸序列如SEQ.ID.NO. 1)、第 二多膚F4 (其氨基酸序列如SE化ID.NO. 2)或第Ξ多膚F8(其氨基酸序列如SE化ID.NO. 3) 中的一種，其多膚序列均來自于家蠶絲素蛋白中的一段類似物及其重復。 陽ο化]實施例一：
[0019] 1、將攜帶有第一多膚F1基因的原核系統表達載體轉染大腸桿菌度L21)細胞，涂 覆于含氨節青霉素的Luria-Bertani固體培養基，倒置放入37°C的生化培養箱培養14~ 16小時；挑取單一菌落放入新鮮含氨節青霉素的4mL的Luria-Bertani液體培養基中，插 入振蕩速度20化/min的空氣搖床37°C振蕩培養8~10小時；將培養的菌液按1:100的比 例于1L含氨節青霉素的新鮮Luria-Bertani液體培養基中擴增培養；當菌液密度達ODe。。 =0. 3~1. 8時加入0~1. 2mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖巧誘導培養1~8小時，4°C 離屯、收集菌細胞。
[0020] 2、將收集的菌細胞用谷脫甘膚轉移酶（GST)親和層析的結合緩沖液重懸混勻， 置于冰上超聲波破碎細胞、釋放蛋白質；破碎完成后120(K)r/min、4°C離屯、lOmin收集含有 第一多膚F1的上清液；表達的含有第一多膚F1序列的蛋白是含有GST標簽的融合蛋白 GST-Flo
[0021] 3、將含有GST-F1的上清液灌注GST親和層析柱，洗脫非特異性蛋白，用谷脫甘膚 洗脫并收集單一蛋白GST-F1，然后灌入G50的Se地adex分子篩層析柱去除谷脫甘膚；采用 凝血酶酶切融合蛋白GST-F1，切除標簽GST釋放第一多膚F1，酶切后的混合溶液進一步灌 注GST親和層析柱，收集流出液即獲得第一多膚F1溶液。
[0022] 4、將第一多膚F1溶液加入脫鹽柱脫凈溶液中的所有鹽成分，收集的第一多膚F1 水溶液立即用液氮凍結，然后置于冷凍干燥機干燥成第一多膚F1粉末；使用時根據需要配 置成一定濃度的水溶液。
[0023] 5、將涂絕洗凈室溫風干，放入2g/L氨氧化鋼溶液中，95°C處理90分鐘；用去離子 水清洗后加入過量的碳二亞胺和N-徑基班巧酷亞胺，調節抑=5. 5,靜置1小時；將涂絕 再用去離子水清洗并制成直徑1. 5cm的圓片，加入0. 002μΜ的F1多膚水溶液500μLpH =7. 5,4°C過夜反應；取出去離子沖洗，風干。
[0024] 6、配置第一多膚F1的水溶液，采用Zeta電位儀測定得第一多膚F1的等電點為 3. 3,即第一多膚F1帶有大量的負電荷；第5步接枝第一多膚F1的涂絕水接觸角為49°， 比原始涂絕的水接觸角77.4°減小了