蠶絲制品的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蠶絲材料加工領域，尤其是提供醫用蠶絲材料。
【背景技術】
[0002] 蠶絲用于生物醫學縫線已有幾十年歷史，觀察到了潛在的宿主免疫反應。這可能 是蠶絲在過往的生物醫學應用中不予考慮的主要原因。引發免疫反應的主因與絲膠蛋白 (sericin)有關。故，從生絲（rawsilk)徹底除去絲膠蛋白，是組織工程化和再生醫學應用 中制備絲織物、但避免生物相容性問題的關鍵步驟。
[0003] 常見的蠶絲是從家蠶（Bombyxmori)幼蟲的蠶繭獲得的。單個蠶繭纖維由被稱為 絲膠蛋白的膠狀蛋白包繞兩個絲素蛋白（fibroin)核心而成，其中由絲膠蛋白將多個絲素 蛋白纖維互相固定。絲素蛋白和絲膠蛋白分別占約75和25%wt.。
[0004] 蠶絲絲素蛋白在形態上以高度有序的晶態纖維結構為特征。這種結構使它不溶 于諸如水、乙醇、稀酸和堿等大多數溶劑。與絲素蛋白相反，球狀的絲膠蛋白易溶于水性溶 劑。紡織業對于去除絲膠蛋白也有極大興趣，因為蠶絲服裝的光澤會被絲膠掩蓋。因此，不 光是生物材料領域要研宄蠶絲，紡織業也在尋找最佳的脫膠方法。這導致出現多種脫膠方 法，包括，堿性溶液（加或不加表面活性劑）、尿素、酒石酸、檸檬酸、或諸如木瓜蛋白酶或內 肽酶等酶類。傳統的脫膠法是將生絲置于有或無表面活性劑的堿性溶液中煮沸，表面活性 劑有助于使絲膠蛋白從纖維結構中脫離出來。值得注意的是，通常是用0.02M碳酸鈉溶液 在KKTC處理30-60min來完成脫膠，尤其是在組織工程化研宄領域。這種堿性脫膠常常以 批量處理，使用的是肥皂或表面活性劑加堿。
[0005] 工業蠶絲生產通常涉及將天然蠶絲纖維（nativesilkfibres)溶解成絲素蛋白 溶液、再用合適的方法如離心法從這種溶液中再加工出（reprocessing)纖維。
[0006] 提供醫用蠶絲材料的方法幾乎是唯一的：將蠶絲纖維以摩爾比1:2:8溶于 含水體系如Lifo或CaCl2/EtOH/水中（CN101736430B)，然后通過諸如離心、電紡絲 (electrospinning)、由水性系統或有機溶劑系統注衆成形（casting)、凝膠化、起泡等等， 將該蠶絲溶液再加工為所需形式的材料（V印ari等，2007,US5, 252, 285A;Sung-WonHa 等，Biomacromolecules4 (3) 2003p. 488-496) 〇
[0007] 但這些由絲素蛋白溶液再加工出的蠶絲材料與天然蠶絲結構不同，常導致三維產 物具有用于多種可能用途、尤其外科領域的用途時不令人滿意的特性（特別是力學特性）。
[0008] 為避免所得的蠶絲結構的這些被削弱的特性，需要一些使用脫膠的蠶絲纖維作 為原材料的技術。蠶絲纖維用紡織工程化技術如編辮（braiding)、打結（knotting)、機 織（weaving)等加工時的高度可加工性，尤其在生物醫學制品領域，已得到Horan等（J Biomech39(12)2006,p. 2232-2240)證實。盡管用紡織工程化技術制備骨架能實現上述 各種進步，仍有一些特殊情況有益于使纖維粘合，這是紡織工程化技術很難或根本不能實 現的。因此研發了不同的策略來用溶劑、粘合劑（埋在樹脂中）或加熱處理（US3 510 390A)使天然以及合成的纖維粘在一起。一種將蠶絲纖維與相鄰纖維粘合的方法用到離 子液體。這些離子液體起到多種生物聚合物包括蠶絲的溶劑的作用。例如，Haverhals等(Macromolecularmaterialsandengineering295,IJanuary2010,p. 425-430)表明，用 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸鹽可以將天然未脫膠的蠶絲"焊接（weld)"到一起。該工藝被描 述和展示為，將纖維表面粘合成無中斷且無解體的結構（US8 202 379BI)。
[0009] 另一種用于將蠶絲纖維彼此粘連的化學試劑是甲酸。早在1915年就有人描述 了從短蠶絲纖維制備均質纖維漿的工藝（GB12374A)。在生物醫學領域，Ghanaati等 (JTERM，2010 (4)p. 464-472)用甲酸將脫膠的無紡蠶絲纖維粘合在一起，形成可移植的穩定 骨架，但不會形成一長串粘在一起的蠶絲纖維。
[0010] 顯然，生物醫學材料（尤其植入材料）必需要有顯著的力學穩定性，特別是要抵抗 壓力時，而這類材料的任何意外斷裂都必須阻止或排除。因此，需要改進的方法來基于改進 了力學特性和形態特性的蠶絲而提供結實耐用的生物醫學材料。這些方法應允許穩健、可 再現且可靠的制備方法；另一方面，這些產物應允許制得的生物材料能加以應用，尤其用于 醫藥和用于細胞培養方法中。
【發明內容】
[0011] 因此，本發明的一個目標是提供這樣的方法；這樣的方法應該也特別適于醫學目 的，尤其適于療法和外科手術。
[0012] 因此，本發明提供制備三維蠶絲制品的方法，其中，將三維蠶絲制品用蠶絲溶劑 (silksolvent)處理一段時間，使該蠶絲制品發生部分解體（partialdisintegration)， 之后，通過物理的（physical) (6-片層（sheet)誘導而將該部分解體的蠶絲制品重新穩固。
[0013] 本發明中，"三維蠶絲制品"應該不僅理解為，其三維中沒有一維不與其它兩維發 生關聯的那些制品，而且理解為，由至少兩層絲素蛋白疊加而限定的那些制品，所述兩層絲 素蛋白中，一層是均勻的絲素蛋白層（區，域，相，等），一層是纖維狀絲素蛋白層，它們從空 間上允許產生非均質（anisotropic)材料性質。
[0014] 本發明的方法提供改進了力學特性的蠶絲結構物（silkconstructs)，尤其絲素 蛋白結構物。這允許將本發明方法可獲得的產物移植到會暴露于特定機械作用力的區域 中。例如，在神經導管（nerveconduit)的例子中，體內移植物可能暴露于能引起這類移植 物崩解的壓力。在這樣的情形中，由未經處理的絲素蛋白構成的（梭織）管紗會崩解，阻礙 所述管紗所覆蓋正在生長的神經。本發明的方法使移植物能抵抗這類引起擠壓（crush)或 挫傷（contusion)的力量。鑒于之前在絲素蛋白結構物上實施了解體步驟或再穩定步驟但 未制出具有本發明所述優點的產物，說明是這兩個步驟的組合導致了產物具有本發明所述 的改進的特性。
[0015] 本發明的部分解體步驟可視為蠶絲制品在暴露于解體溶液，蠶絲溶劑的區域內的 部分溶解。這涉及絲素蛋白中使之成形的beta-片層結構的部分解體。解體可以達到終產 物所需的程度，例如，僅僅靠近表面或貫穿整個蠶絲制品，當然是產物尚未變成溶液。起始 材料（即，蠶絲制品）的總體形狀在部分解體步驟的全過程中基本保留。因此，蠶絲溶劑只 是施用有限的時間段，不會一直用到徹底溶解的程度（達到平衡）。蠶絲（絲素蛋白）材 料（再次）徹底液化成溶液或懸浮液的情形在本發明中不會發生，僅僅是產物的有限區域 內發生部分的去固化過程。此（部分）"溶解"步驟允許絲素蛋白分子更緊密地聚集在以 形成連續相為特征的產物的解體區域（disintegratedarea)內部。在蠶絲制品上實施的 解體步驟所能達到的程度因此導致本發明終產物的不同產物特征。
[0016]可見，本發明的"解體"明顯有別于其它蠶絲加工步驟，如脫膠（"脫膠 (degumming) "是指將兩類蛋白彼此分離，S卩，使絲膠蛋白脫離絲素蛋白纖維，它類似于使外 殼與核心脫咼）。
[0017] 在再穩定步驟中，蠶絲制品的解體部分再次固化，但形成了與該蠶絲制品的未解 體部分相比有不同形態和力學特征的區域。由于該再穩定步驟，蠶絲制品再次徹底固化，通 常形成非均質的終產物，其中最顯著暴露于溶絲液的表面經歷了最廣延的結構變化，而蠶 絲制品的內部（或未暴露于溶絲液（"蠶絲溶劑"）的表面）能夠維持幾乎不變或至少未變 到更多暴露于蠶絲溶劑的部位所達到的程度。本發明的再穩定步驟因此引起形態上的晶樣 狀態（morphologicalcrystalline-likestate)。所述再穩定步驟是通過物理的0-片層 誘導來進行的。解體引起蠶絲的"無規"結構。此后，解體的蠶絲經物理處理而實現片 層再折疊。實施該步驟的典型方式是除去無規蠶絲形式中解體區的水分子，直至發生這類 再折萱。
[0018] 蠶絲絲素蛋白是多形性材料，有三種不同的相（phases)，通常稱為蠶絲I、II和 III。蠶絲I代表一種螺旋且無規卷曲的水溶性結構狀態，可見于離心處理前的蠶腺體或 作為（含水）蠶絲溶液（也稱再生絲（regeneratedsilk))。蠶絲II的特征在于不對稱 0 -片層結構，其中甘氨酸的氫側鏈大都暴露在0 -片層的一側、丙氨酸的疏水甲基側鏈在 另一側。結果，各個片層通過并肩式排列而自我裝配，通過強氫鍵和范德華力而穩定。
[0019] 通過暴露于熱或剪切力，引起蠶絲I向蠶絲II的結構變化。這種相變（phase transition)也可以通過用甲醇或其它促進蠶絲分子失水的試劑處理蠶絲結構來獲得。結 果，從無規卷曲（蠶絲I)向片層形成（蠶絲II)的轉變因鏈-鏈相互作用的增強而被 誘導。除了所述相變，此過程還確保水穩定性蠶絲結構。其它引起和控制beta-片層形成 的方法是，高壓蒸汽滅菌（Park等，J.Mat.Sci43 (2008)，6967-6985)和水冷退火法（water annealingmethods,Hu等，Biomacromol. 12(2011)，1686-1696)。
[0020] 再穩定步驟優選按照本發明通過用再穩定溶液處理來進行。也可以使用不同的再 穩定溶液的多種組合。
[0021] 用再穩定溶液進行的再穩定可以用任何能實現蠶絲的e-片層形成的溶液來進 行。所述結晶（通過用再穩定溶液處理進行的再穩定）常常由兩種目前業內的方法來誘導， 是浸沒在諸如甲醇或乙醇等醇溶液中。醇浸沒既簡單又快速，但如果必須要避免使用醇的 話，可以使用諸如甲酸等無醇再穩定溶液。
[0022] 作為本發明的測試系統，研宄了用于神經修復的蠶絲絲素蛋白對照（control)結 構。更具體地，對坐骨神經（N.ischiadicus)缺損的搭橋已在大鼠體內觀察到，顯示出令人 意外的結果（見實施例部分）。
[0023] 在本發明過程中意外發現，蠶絲制品（尤其三維絲素蛋白產物），在應用了本發明 的兩個處理步驟后，可以有效改進其力學特性，尤其是它們抵抗體內移植后瓦解的抗性。這 使得能產生與經絲素蛋白溶液再處理（無本發明的加固步驟）的蠶絲纖維相比具有顯著優 勢和潛能的三維蠶絲制品。
[0024] 根據本發明提供更結實耐用的復雜蠶絲結構，給當今手術帶來明顯好處。而且， 該制備過程整體上是可靠的，適于進行工業化大規模生產。優選地，本發明的蠶絲溶劑包 括LiBr、LiSCN、六氟代-2-丙醇（HFIP)、含乙醇和0&(：12的混合物或含甲醇和硝酸鈣的混 合物；或它們的混合物。根據優選實施方案，LiBr在蠶絲溶劑中的使用濃度是1-10M，優 選3-10M，尤其5-7M。根據優選實施方案，LiSCN的使用濃度是1-17. 5M，優選5-15M，尤其 8-12M。根據優選實施方案，HFIP在溶液中的使用濃度是1-100 % (v/v)，優選50-100 % (v/v)HFIP，尤其90-100 % (v/v)HFIP。乙醇可以，例如，在蠶絲溶劑中使用含水溶液，其 包含1-50% (v/v)乙醇，優選5-40% (v/v)乙醇，尤其10-30% (v/v)乙醇。CaCl2可以， 例如，在蠶絲溶劑中與乙醇的摩爾比為1 :〇? 3-1:3 (即，ImolCaCl2:0. 3molEtOH至Imol CaCl2:3molEt0H)，優選 1:1-1:2. 5,尤其 1:1. 5-1:2. 2。
[0025] 本發明的方法適用于廣泛多種不同的蠶絲制品，尤其絲素蛋白制品。優選，所 述三維蠶絲制品是梭織物（wovenfabric),無紡織物（non-wovenfabric),管紗（tube), 編織物（knittedproduct)或壓制品（pressedproduct)。盡管本發明的方法可以用任何 絲架（silkscaffold)來實施，但所述方法特別適于處理由蠶絲纖維構成的骨架。那些制 品可以轉而形成一個區域有解體而其它區域仍保留原始絲纖維結構的絲架，優選提供非均 質（anisotropic)制品，S卩，表面已解體、內部仍包含絲纖維的制品。尤其優選使用絲素蛋 白制品或由天然蠶絲纖維構成的梭織制品（wovenproduct)。本發