一種用于組織損傷修復的生物補片的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及醫療器械領域，特別涉及一種用于組織損傷修復的生物補片。
【背景技術】
[0002]現實社會中交通事故、工傷事故、運動意外及臨床手術等事件均會造成組織損傷，臨床上多使用作為生物補片進行替代和修復人體組織的材料。生物補片是指取自同種一種對組織，經脫細胞處理去除組織中含有的各種細胞而完整保留細胞外基質的三維框架結構并能用于修復人體軟組織的材料。根據組織來源可分為同種異體材料如真皮脫細胞基質、羊膜、硬腦膜等，異種異體材料如豬小腸黏膜下層、牛、馬的心包、牛腹膜等。雖然這種天然生物補片已經商品化，但是制備繁瑣，價格高昂。尋找價格低廉、簡便易得、生物相容性好的人工合成生物補片來替代天然生物補片仍然是研究的熱點。
【發明內容】
:
[0003]本實用新型的目的在于提供一種生物相容性好、價格低廉、簡便易得的用于組織損傷修復的生物補片。
[0004]本實用新型的技術解決方案是:
[0005]一種用于組織損傷修復的生物補片，包括生物材料基底層和細胞基質層，基質層附著在基底層上，基底層與細胞基質層的接觸面上設有若干個平行的溝槽。溝槽可以為突出于基底層表面的凸形溝槽，也可以為自基底層表面向內凹陷的溝槽形狀。溝槽為橫向或縱向排布。
[0006]優選溝槽的尺寸為:寬為10-50 μπι，深為10-30 μπι。
[0007]上述的生物補片，所述生物材料基底層上的孔隙率為50% -90%，且孔徑為10 μ m-100 μ mD
[0008]上述的人工合成生物補片，所述生物材料基底層厚度為0.l_3mm。
[0009]上述的人工合成生物補片，所述生物材料基底層由絲素蛋白、殼聚糖、膠原、聚乳酸或聚羥基乙酸中的一種或幾種制成。
[0010]上述的生物補片，所述細胞基質層是自體的或同種異體來源細胞分泌形成后脫細胞而獲得，所述細胞是施萬細胞、皮膚來源的成纖維細胞、皮膚干細胞、骨髓間充質干細胞、臍血干細胞或誘導多潛能干細胞中的一種或幾種。
[0011]上述生物補片不含有發泡劑和/或交聯劑。
[0012]本實用新型還公開了上述生物補片的制備方法，
[0013](1)設計PDMS彈性印章紋路，將生物材料溶液加到印章上，成型脫模后采用凍干的方法制備獲得表面具有溝槽紋路的生物材料基底層；
[0014](2)將生物材料基底層與細胞進行培養，得到貼附生長有細胞的生物材料基底層；
[0015](3)將生長有細胞的生物材料基底層進行脫細胞處理，將其進一步進行凍干，得到生物補片。
[0016]本實用新型的一個優選方案如下:
[0017]根據微溝槽的尺寸大小對細胞的形狀和鋪展行為影響的原則，設計可以引導神經細胞的取向分布的具有溝槽狀的微圖形結構。
[0018]本實用新型所使用的彈性印章為聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)，其制備方法為將室溫下配制好的PDMS液體和交聯劑按10:1的比例混合均勻后，澆鑄到事先采用掩膜曝光獲得的具有橫向或縱向的溝槽狀微圖形化分布的硅片基母模板上，然后將其放入真空干燥箱中抽真空排除氣泡，并進行干燥固化，最后進行固化后剝離即得到平面PDMS彈性印章。
[0019]用乙酸溶解殼聚糖配制一定濃度(1%、2%和5% )的溶液，然后將該溶液滴加在PDMS上，置于-60°C —90°C，冷凍2-4小時，將冷凍后殼聚糖冰體置于堿性溶液中和固定，用水清洗；對定型的殼聚糖基底層進行冷凍干燥，得到具有多孔結構、表面具有溝槽狀分布的多孔殼聚糖基底層。
[0020]將多孔殼聚糖基底層進行三維細胞培養得到表面貼附生長有細胞的殼聚糖基底層取出。將生長有細胞的殼聚糖基底層進行脫細胞處理，將其進一步進行凍干，得到本實用新型所述生物補片。
[0021]使用掃描電鏡檢測本實用新型所述生物補片孔隙的孔徑為10 μπι-100 μπι。
[0022]本實用新型生物補片基底層同時具有多孔和溝槽紋路結構，不但可以調控細胞的取向性生長和分布，溝槽紋路結構所具有的力學性能可以使細胞基質層能夠更好的粘附在基底層上，避免脫落。本實用新型所述產品具有穩定的結構，合適的孔徑、孔隙率及通透性，能夠模擬正常組織結構，能夠提供組織生長的管道及細胞基質，并且可以承載利于組織修復和再生的細胞，本實用新型的產品所用材料為天然可降解性材料，與人體有著良好的生物相容性，制得的產品不含有由制備工藝帶入的外源性毒、副作用的發泡劑和交聯劑。本實用新型具有很好的抗拉強度且具有細胞基質層，更有利于輸送細胞生長過程所需的營養物質，給細胞提供良好的生長環境。使用效果好。本實用新型方法簡便易行。
【附圖說明】
[0023]圖1為本實用新型所述生物補片基底層表面豎向溝槽紋路示意圖。
[0024]圖2為本實用新型所述生物補片基底層表面橫向溝槽紋路示意圖。
[0025]圖3為細胞在本實用新型所述生物補片表面圖形化的基底層上取向性生長示意圖。
[0026]圖4為本實用新型所述凸形溝槽的生物補片結構示意圖(1為基底層，2為溝槽，3為細胞基質層)。
[0027]圖5為本實用新型所述凹形溝槽的生物補片結構示意圖(1為基底層，2為溝槽，3為細胞基質層)。
【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例對本實用新型作進一步說明。
[0029]在本實用新型中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0030]下面結合具體實施例并參照數據進一步詳細描述本實用新型。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本實用新型，而非以任何方式限制本實用新型的范圍。
[0031 ] 在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0032]實施例1
[0033](1)施萬細胞的培養及純化
[0034]取新生一天SD大鼠，處死后酒精消毒，取雙側坐骨神經，置于冰浴操作臺去除神經外膜及黏連組織，膠原酶/胰酶混合消化完全后離心棄上清液，完全培養基重懸細胞，接種到PDL事先包被好的培養皿中培養。24小時更換成含有阿糖胞苷(10 μΜ)的完全培養基培養48小時，更換為含有HRG(50ng/ml)和Forsklin (2 μ Μ)的完全培養基繼續培養，每3天換液，直到細胞融合。待細胞融合后，胰酶消化后離心得到細胞沉淀，用1ml含Thyl.1的完全培養基(1:1000)重懸細胞，冰上孵育2小時；離心棄上清，用DMEM和補體的混合物(3:1)重懸細胞，37°C孵育1小時，離心后完全培養基清洗2次，重新接種于培養皿中，隔天換液，細胞長滿后即可以使用。
[0035](2)皮膚來源的成纖維細胞的培養
[0036]取新生1天的SD大鼠，處死后酒精消毒，取出背部皮膚置于預冷的解剖液中小心地剔除皮下組織(脂肪和皮下筋膜層、血管等)；PBS清洗3次后，用手術刀片切成小塊(〈lmmXlmm)，以I型膠原酶(lmg/ml)完全消化后離心棄上清液，完全培養基重懸細胞，接種到培養皿培養，細胞融合90%后傳代培養。成纖維細胞在原代培養過程中會有上皮細胞污染，大多數雜細胞(上皮和內皮細胞)會在幾次傳代后逐漸死亡。因此，本實用新型所用細胞為傳3代以上細胞。
[0037](3)皮膚干細胞