一種生物性復合氣管補片的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及醫療器械領域，尤其涉及一種生物性復合氣管補片。
【背景技術】
[0002]由于氣管先天畸形、腫瘤切除、外傷等各種病因，常會導致氣管壁部分缺失。如果直接將氣管縱行縫合，可能會造成醫源性氣道狹窄，引起一系列并發癥包括反復發作的致命性肺炎，此時將氣管切斷再吻合是目前解決這一難題的主要方法。但是，行長段氣管切除術(成人大于全長的50%，兒童大于30%)后，由于兩斷端距離太遠造成吻合口張力過大，手術無法進行。故尋找一種良好的補片材料對缺損的氣管壁進行修補，對于解決這一臨床問題有著重要的意義。
[0003]同種異體移植作為最經典的器官替代、修復和重建方法，已經有百余年的歷史，并在多個領域取得一定的成功。但是，一方面供體器官的嚴重缺乏在世界范圍內面臨的難題；另一方面，由于控制排異反應存在，需要長期服用免疫抑制劑所帶來的巨大副作用不容小覷。即便是在長期堅持服用藥物的情況下，慢性排異反應也無法阻止，移植物最終會失去功能，從而需要再次手術或其他替代治療。更重要的是，研究表明氣管粘膜上皮細胞具有很高的MHC I和MHC II抗原，異體上皮細胞是免疫攻擊的把目標和重要環節，所以造成氣管的同種異體移植成功率更低、風險更大。降低移植物的免疫原性，減少排異反應是同種異體移植亟待解決的問題。
[0004]組織工程是在體外構建具有生命力的活體植入體內。從而達到修復缺損、重建功能、提高生活質量之目的。理想的氣管補片應該最大限度地降低移植物的免疫原性，并且盡可能的保留細胞外基質。組織工程氣管正好滿足了這些基本條件，是目前該領域研究的熱點。2008年瑞典的Macchiarini醫生利用氣管脫細胞支架材料完成了第一例成功的組織工程氣管移植手術，標志著氣管重建的組織工程時代的開始。然而，由于這一技術仍然依賴于供體捐獻氣管以制作脫細胞氣管支架，所以氣管來源仍然面臨挑戰。另一方面，由于受者的細胞要經過很長一段時間的復雜培養工藝才能定植、攀附到脫細胞氣管支架上，所以這種制作方法的效率仍然有待提高。
[0005]最近的十年，增材制造技術，也就是人們熟悉的“三維打印技術”的快速發展，為生物醫學界帶來新的啟迪。它是一種個性化制備復雜支架和組織工程植入物的多功能快速成型技術。而生物打印在傳統三維打印的基礎上，進一步實現了對于細胞空間分布的精確定位。可是，目前研究得到的三維打印氣管補片存在生物相容性差、細胞成活率低、制作工藝復雜、產品可塑性差、無法滿足個性化需求等缺點。
【實用新型內容】
[0006]本實用新型為解決現有技術中的上述問題提出了一種結合3D打印技術的生物性復合氣管補片，合理調整補片的內部層級結構，完善內部結構設計，能夠臨床提供安全可行的氣管補片產品。
[0007]本實用新型解決上述技術問題所采取的技術措施為:
[0008]—種生物性復合氣管補片，包括上皮細胞復合材料層、軟骨細胞復合材料層及硬材料層，所述軟骨細胞復合材料層置于所述上皮細胞復合材料層和硬材料層之間。
[0009]為進一步優化上述技術方案，本實用新型所采取的技術措施還包括:
[0010]生物性復合氣管補片平面結構可以為矩形、圓形或任意多邊形。
[0011]生物性復合氣管補片立體結構可以為圓管型、C型圓管型或半圓管型。
[0012]在制備本實用新型的生物性復合氣管補片時，包括以下步驟:
[0013]步驟一，利用支氣管鏡，無菌刷取支氣管上皮細胞，體外培養擴增；提取耳廓軟骨細胞，消化、分散，體外培養擴增；
[0014]步驟二，將膠原和透明質酸與去離子水混合，經濾菌器過濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射徹底滅菌，均勻分散于滅菌培養液中；
[0015]步驟三，將所述步驟二中所得的軟材料和培養液以1:1的體積比相混合，制成重懸細胞的軟材料混合物；
[0016]步驟四，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風櫥內使二氯甲烷自然揮發，制得硬材料混合物；
[0017]步驟五，分別將所述步驟一中擴增培養的支氣管上皮細胞和軟骨細胞消化、重懸、計數并離心，棄去上清后，重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料；
[0018]步驟六，將所述步驟五中的支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料分別置于兩只低溫墨倉內，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于3D打印機上備用；將所述步驟四中的硬材料混合物置于高溫墨倉內，安裝直徑為0.1毫米的打印機針頭，加載于3D打印機上備用；
[0019]步驟七，使用建模軟件構建貼合的三層矩形片狀結構模型，依次為上皮細胞層(即上皮細胞復合材料層)、軟骨細胞層(即軟骨細胞復合材料層)和硬材料層，所述上皮細胞層由支氣管上皮細胞生物復合材料組成，所述軟骨細胞層由軟骨細胞生物復合材料組成，所述硬材料層由硬材料混合物組成；
[0020]步驟八，將結構模型導入打印機并進行3D打印，得到生物性復合氣管補片。
[0021]為進一步優化上述技術方案，本實用新型所采取的技術措施還包括:
[0022]上述步驟八具體包括:
[0023]步驟1，將結構模型導入打印機驅動程序，分層解析；
[0024]步驟2，將一片無菌載玻片置于打印機作業平臺上，校準定位打印機針頭；
[0025]步驟3，設置打印機運行參數:硬材料混合物加熱溫度為150-210°C，內部結構間隙為0.2-0.5毫米，墨倉內驅動氣壓為0.1-0.5Bar，針頭運行速度為5_10毫米/秒；支氣管上皮細胞生物復合材料和軟骨細胞生物復合材料保持室溫，內部結構間隙為0.1-0.3毫米，墨倉內驅動氣壓為0.1-0.3Bar，針頭運行速度為7_13毫米/秒；
[0026]步驟4，啟動打印流程，按照設置的運行參數打印硬材料層；
[0027]步驟5，打印軟骨細胞層，完成軟骨細胞層的打印后暫停打印作業，用超聲霧化機將三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于軟骨細胞層上，使之充分交聯；
[0028]步驟6，繼續打印作業，打印上皮細胞層，完成后用超聲霧化機將三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于上皮細胞層上，使之充分交聯；
[0029]步驟7，用鑷子小心將制作完成的生物性復合氣管補片從載玻片上揭下，無菌條件下修剪成受體所需求的形狀。
[0030]上述步驟二為將10%膠原和5%透明質酸按照質體積比與去離子水混合，經濾菌器過濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射24小時徹底滅菌，以8%質量體積比分散于滅菌培養液中。
[0031]上述步驟四為將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風櫥內使二氯甲烷自然揮發，制得硬材料混合物。
[0032]上述步驟五為分別將所述步驟一中擴增培養的支氣管上皮細胞和軟骨細胞消化、重懸、計數并離心，棄去上清后，按照1 X 106個/毫升的細胞濃度重懸于所述步驟三