神經氨酸酶及其抑制劑在心肌缺血及心肌梗死中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及藥物靶標的發現和應用，具體涉及神經氨酸酶及 其抑制劑在心肌缺血及心肌梗死中的應用。
【背景技術】
[0002] 心血管疾病是威脅人類生命健康的重大疾病，隨著社會進步和人民生活水平提 高，其發病率逐年增長，2014年因心血管疾病死亡人數約占全球總死亡人數的30 %，而心肌 缺血性疾病又是心血管疾病中的焦點，并可發展為心律失常、心肌梗死，常可危及生命。因 而如何切實有效地減輕因心肌缺血引起的損傷已成為當今醫藥界面臨的一個熱點問題。 [0003]心肌缺血損傷是由于心肌細胞供氧不足而造成的心肌細胞壞死或功能受損，目前 臨床常用藥物多是通過改善細胞能量代謝、抑制炎癥反應、保護血管、減輕心肌細胞鈣超載 等機制治療心肌缺血，常見的包括硝酸脂類藥物如硝酸甘油，硝酸異山梨酯;受體阻斷劑 如普萘洛爾；鈣通道阻斷劑如硝苯地平，維拉帕米以及抗血小板和抗血栓形成藥如雙嘧達 莫等。
[0004] 神經氨酸酶(Neuraminidase，ΝΑ)是流感病毒表面的一種糖蛋白，具有糖苷外切酶 活性，它可以裂解細胞表面唾液酸和鄰近乳糖之間的糖苷鍵。在流感病毒的整個生命周 期中，ΝΑ對于流感病毒感染細胞起著識別受體的作用，同時可以促進病毒進入受體細胞，這 個過程對于病毒感染和傳播都起著十分關鍵的作用。因此神經氨酸酶是抗流感藥物研發的 重要靶標。目前臨床上使用的神經氨酸酶抑制劑扎那米韋和磷酸奧司他韋在流感的預防和 治療中發揮了重要作用。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一目的在于提供神經氨酸酶作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治 療心肌缺血損傷的藥物中的應用；
[0006] 本發明的第二目的在于提供神經氨酸酶的抑制劑在制備用于預防、緩解和/或治 療心肌缺血損傷的藥物中的應用；
[0007] 本發明的第三目的在于提供一種藥物制劑，該藥物制劑中含有神經氨酸酶抑制劑 和藥學上可以接受的載體。
[0008] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0009] 神經氨酸酶作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷的藥物中的 應用。
[0010] 進一步地，所述心肌缺血為心肌梗死引發的心肌缺血。
[0011] 神經氨酸酶的抑制劑在制備用于預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷的藥物中的 應用。
[0012] -種藥物制劑在預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應用，包含神經氨酸酶的 抑制劑和藥學上可以接受的載體。
[0013] 進一步地，根據所述的藥物制劑在預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應用， 所述神經氨酸酶的抑制劑為扎那米韋。
[0014] 進一步地，根據所述的藥物制劑在預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應用， 所述神經氨酸酶的抑制劑為磷酸奧司他韋。
[0015] 進一步地，根據所述的藥物制劑在預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應用， 所述神經氨酸酶的抑制劑為黃連堿。
[0016] 進一步地，根據所述的藥物制劑在預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應用， 所述神經氨酸酶的抑制劑為扎那米韋和黃連堿的組合物。
[0017] 進一步地，根據所述的藥物制劑在預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應用， 所述神經氨酸酶的抑制劑為磷酸奧司他韋和黃連堿的組合物。
[0018] 進一步地，根據所述的藥物制劑在預防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應用， 所述心肌缺血為心肌梗死引發的心肌缺血。
[0019] 本發明的優點：
[0020] 1、本發明提供了神經氨酸酶與心肌缺血損傷的關聯性，證明通過抑制神經氨酸酶 的活性可以緩解心肌缺血損傷，神經氨酸酶可以作為篩選預防、緩解和/或治療心肌缺血損 傷藥物的靶標；
[0021] 2、本發明證明了神經氨酸酶抑制劑對心肌缺血損傷的緩解作用，神經氨酸酶抑制 劑通過降低神經氨酸酶的水平改善心肌缺血損傷；
[0022] 3、本發明提供了 一種藥物制劑，該藥物制劑中含有神經氨酸酶抑制劑和藥學上可 以接受的載體，可以用于降低神經氨酸酶的水平從而改善心肌缺血損傷。
【附圖說明】
[0023]圖1A為空白對照組大鼠心電圖；
[0024]圖1B為異丙腎上腺素造模后模型組大鼠心電圖；
[0025]圖2A為異丙腎上腺素造模后扎那米韋低劑量組大鼠心電圖；
[0026]圖2B為異丙腎上腺素造模后扎那米韋高劑量組大鼠心電圖；
[0027]圖3A為異丙腎上腺素造模后磷酸奧司他韋低劑量組大鼠心電圖；
[0028]圖3B為異丙腎上腺素造模后磷酸奧司他韋高劑量組大鼠心電圖；
[0029]圖4A為空白對照組大鼠心臟病理切片電鏡圖；
[0030]圖4B為異丙腎上腺素造模后模型組大鼠心臟病理切片電鏡圖；
[0031]圖5A為異丙腎上腺素造模后扎那米韋低劑量組大鼠心臟病理切片電鏡圖；
[0032]圖5B為異丙腎上腺素造模后扎那米韋高劑量組大鼠心臟病理切片電鏡圖；
[0033]圖6A為異丙腎上腺素造模后磷酸奧司他韋低劑量組大鼠心臟病理切片電鏡圖； [0034]圖6B為異丙腎上腺素造模后磷酸奧司他韋高劑量組大鼠心臟病理切片電鏡圖；
[0035] 圖7為異丙腎上腺素造模后各組心肌神經氨酸酶表達水平的影響。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。本發 明中，未做詳細描述或特別強調的試驗材料或試驗方法均為本領域常規試驗材料或試驗方 法，本領域普通技術人員可以獲得該試驗材料或具備開展該試驗的能力。
[0037]實施例1:神經氨酸酶抑制劑扎那米韋和磷酸奧司他韋對心肌缺血損傷的改善作 用
[0038] 一、試驗材料 [0039] 1、儀器和試劑
[0040] 生理記錄儀:BL-420S生理機能實驗系統（中國成都泰盟）、動物呼吸機HX-300S(中 國成都泰盟）、MP120-1電子秤(上海第二天平儀器廠）、動物手術器械等。
[0041]鹽酸異丙腎上腺素（ISO)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度>99%、 0.9%生理鹽水購自國藥集團、扎那米韋(ZA)購自大連美侖生物技術有限公司，純度>98%、 磷酸奧司他韋(0S)購自大連美侖生物技術有限公司，純度>98%、3%水合氯醛。
[0042] 2、試驗動物
[0043] SD雄性大鼠120只，購自上海西普爾-必凱公司。
[0044]二、試驗方法
[0045] 1、IS0造大鼠急性心肌缺血模型:選取SD大鼠，根據體重分為空白對照組、模型組、 ZA高劑量組（0.5 mg/kg i.v.)、ZA低劑量組（0.2 mg/kg i.v.)、0S高劑量組（10 mg/kg 口.〇.)、03低劑量組（5 11^/1^口.〇.)六組，每組10只。給藥組連續給藥3天，第二天給藥30 min后皮下注射IS0,劑量為60mg/kg，第三天同樣給藥30 min后皮下注射IS0,劑量為60mg/ kg，第4天收集血液、心臟等組織樣本。
[0046] 2、左冠狀動脈前降支結扎造大鼠急性心肌缺血模型:選取SD大鼠，根據體重分為 空白對照組、模型組、ZA高劑量組(0.5 mg/kg i.v.)、ZA低劑量組(0.2 mg/kg i.v.)、0S高 劑量組（10 mg/kg ρ.ο.)、0S低劑量組(5 mg/kg ρ.ο.)六組，每組10只。給藥組預先24 h和 12 h給藥，而后將大鼠3%水合氯醛10 ml/kg麻醉，仰臥固定于大鼠板上。于左側4、5肋間切 口撕開心包，暴露心臟，輕壓胸廓擠出心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠狀動脈左前降 支，以0號線立即結扎冠狀動脈左前降支根部(肺動脈圓錐與左心耳處），將心臟送回胸腔， 并擠出胸腔內血液和氣體，迅速關閉胸腔，縫合皮膚，開胸時間不超過30 s。采用BL-420S生 理機能實驗系統對每只大鼠進行心電圖的測定。造模后24h收集血液、心臟等組織樣本:摘 眼球取血，分離血清，-20°C保存待測；脫頸椎處死動物，迅速取出心臟，以冰生理鹽水洗去 殘留血液，除去大血管、結締組織，濾紙吸干，稱全心重。取心尖部位至10%福爾馬林溶液中 固定，用于病理學檢查，其余心臟減碎后，以10倍量Tri s-HCl (pH7.4)緩沖液在冰浴下制成 10%的心臟勾衆，于4°C，1000g離心10min，棄沉淀，取上清進行各項酶學指標的檢測。
[0047] 3、觀察指標及方法
[0048] 3.1記錄心電圖
[0049] 采用標準Π 導聯記錄各組大鼠心電圖
[0050] 3.2觀察心臟病理切片
[0051] 取心尖部位的心肌組織經10%甲醛溶液固定，常規取材，脫水，石蠟包埋，制片(4μ m厚），ΗΕ染色，在光學顯微鏡下觀察。
[0052] 3.3心肌神經氨酸酶水平測定方法
[0053]使用ELISA法檢測大鼠心肌神經氨酸酶水平，檢測試劑盒為神經氨酸酶檢測試劑 盒，按照檢測試劑盒的操作說明書進行測定。
[0054] 3.4血清心肌損傷指標CK-MB和D-LDH檢測方法
[0055] 分別按照CK-MB檢測試劑盒（羅氏）和D-LDH檢測試劑盒（Invitrogen)操作說明書 測定 CK-MB 和 D-LDH。
[0056]三、試驗結果 [0057] 1、對心電圖的影響
[0058]圖1~圖3所示的典型心電圖記錄結果表明：異丙腎上腺素造模后，模型組出現明 顯心肌損傷，神經氨酸酶抑制劑扎那米韋和磷酸奧司他韋能有效改善心肌損傷，并呈現劑 量依賴性。
[0059] 2、對心肌細胞形態的影響
[0060]圖4~圖6所示的典型心臟病理切片表明：異丙腎上腺素造模后，模型組出現明顯 心肌損傷，表現為心肌細胞形態不規則，細胞間裂隙明顯，大量炎癥細胞浸潤，神經氨酸酶 抑制劑扎那米韋和磷酸奧司他韋能有效改善心肌損傷，并呈現劑量依賴性。
[0061 ] 3、對心肌神經氨酸酶表達水平的影響
[0062]從表1和圖7可以看出，異丙腎上腺素造模后，ELISA法檢測大鼠心肌細胞中神經氨 酸酶表達，結果顯示模型組心肌缺血后神經氨酸酶表達上調，神經氨酸酶抑制劑扎那米韋 和磷酸奧司他韋能有效抑制心肌缺血引起的神經氨酸酶表達升高，并呈現劑量依賴性。 [0063] 表1各組心肌神經氨酸酶表達水平
[0064]
[0065] 4、對心肌損傷指標在血清中表達水平的影響
[0066] CK-MB和D-LDH是心肌缺血損傷的血清標志物，異丙腎上腺素造急性心肌缺血模型 后，血清CK-MB、LDH水平上升，給藥組則顯著性降低。結果見表2。
[0067] 表2血清CK-MB、D-