一種重組人透明質酸酶凍干制劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于制劑領域，涉及一種重組人透明質酸酶凍干制劑及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 透明質酸(hyaluronic acid，HA)又稱糖醛酸、玻璃酸或玻尿酸，是由D-葡萄糖醛 酸及N-乙酰葡糖胺兩個雙糖單位重復連接組成的直鏈高分子糖胺多聚糖，廣泛地存在于脊 椎動物的結締組織、粘液組織、眼球之晶狀體及皮膚中，在胚胎、軟骨、滑液、玻璃體、臍帶、 雞冠等組織中尤為豐富。透明質酸是人體組織基質中分布最廣的一種酸性黏多糖，在體內 具有多種功能，如構成多種基質、限制水分及其它細胞外物質擴散的作用，調節滲透壓，調 控大分子物質轉運，在細胞周圍形成物理屏障等。由于透明質酸在體內通過形成網狀屏障 填充在胞外基質膠原蛋白纖維骨架之間，限制了藥物大分子物質的皮下擴散，降低藥物到 達血管的速度，且限制皮下注射的液體體積。
[0003] 透明質酸酶(115^1111'0111(^86，說386)，也稱玻璃酸酶，是一種能夠特異性水解透明 質酸、從而提高組織中液體滲透能力的蛋白內切酶，在體內廣泛分布于血清、腦和胎盤等組 織和體液中。通過斷裂葡糖胺的C1和葡萄糖醛酸C4間的葡糖酸鍵對透明質酸水解，暫時降 低細胞間質的粘度，促使皮下輸液、局部積貯的滲出液或血液加快擴散而利于吸收。
[0004] 透明質酸酶于1928年被發現，1940年研究確定命名，1948年即被FDA批準在美國上 市，作為擴散劑與其他藥物合用。2001年，FDA將透明質酸酶列為短缺藥品。2004年，FDA批準 了兩種透明質酸酶制劑一ISTA Pharmaceuticals公司的羊型透明質酸酶(Vitrase)和 Amphastar Pharmaceuticals公司的牛型透明質酸酶(Amphadase)。2005年底，FDA又批準了 2種新型透明質酸酶制劑的上市申請，即Pr imaPharm公司研制的純化牛睪丸透明質酸酶 (Hydase)和Halozyme制藥有限公司與百特(Baxter)公司共同研制的重組人透明質酸酶 (Hylenex)。在獲批的五種透明質酸酶中，僅有Hylenex為基因工程重組的人源性透明質酸 酶，其他四種均為動物來源的提取產品。由于眾所周知的原料來源問題及動物污染風險等 原因，三種動物來源的產品先后停產。目前市售產品僅剩下羊型透明質酸酶Vitrase和重組 人透明質酸酶Hylenex兩種。
[0005] 美國Halozyme公司的重組人透明質酸酶Hylenex是采用重組DNA技術在CH0細胞中 高效表達，高度純化后獲得的產品，具有純度高，免疫原性低等優點，因此快速取代動物提 取的透明質酸酶而廣泛應用。臨床上透明質酸酶與其他注射藥物合用，增加后者的吸收和 分散，可用于皮下輸液，促進手術及創傷后局部水腫或血腫消散以及皮下尿道造影術之中 (改善造影劑硫酸鋇的再吸收）。透明質酸酶還常與局麻藥在眼科手術時合用，加快麻醉藥 的起效速度。此外，全球生物制藥巨頭如羅氏、強生等公司將重組人透明質酸酶Hylenex和 其旗下的數個全球銷量超過50億美金的抗體產品聯用于腫瘤治療，將昂貴的抗體給藥方式 由傳統的靜脈輸液替換為皮下注射，極大的簡化了腫瘤病人的治療方案，大幅降低病人和 醫療系統的費用支出。
[0006] 市場上廣泛使用的透明質酸酶是一種液體制劑，液體制劑有效成分為重組人透明 質酸酶，其余成分為每毫升8.5mg氯化鈉，1.4mg磷酸氫二鈉，lmg人血白蛋白，1.5mg L-甲硫 氨酸，0.2mg吐溫80，產品的貨架期為24個月。該制劑的缺點在于透明質酸酶在液體制劑中 活性穩定性較差，運輸，倉儲，使用均不方便。更重要的為了維持酶的活性，液體制劑中使用 了人血白蛋白，人血白蛋白不僅成本高且來源于血漿，被病原體感染的風險高。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種重組人透明質酸酶凍干制劑及 其制備方法和應用。
[0008] 為達此目的，本發明采用以下技術方案：
[0009] -方面，本發明提供一種重組人透明質酸酶凍干制劑，所述重組人透明質酸酶凍 干制劑以10000支計算，包含如下組分：
[0010] 重組人透明質酸酶 1400000~500000000IU 緩沖劑 5~1:0 g 冷凍保護剤 60~180 g 賦形劑 1節~3W g 酶活保護劑 5~12g 表面活性劑 0.3~5 g。
[0011] 在本發明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含重組人透明質酸 酶 1400000 ~500000000IU，例如 1400000IU、1500000IU、1800000IU、1700000IU、1800000IU、 1900000IU、2000000IU、3000000IU、5000000IU、8000000IU、10000000IU、50000000IU、 80000000IU、100000000IU、300000000IU或500000000IU。
[0012] 在本發明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含緩沖劑5~10g， 例如5g、5 · 3g、5 · 5g、5 · 8g、6g、6.3g、6 · 5g、6.8g、7g、7 · 2g、7 · 5g、7 · 8g、8g、8 · 3g、8.5g、8.8g、 9g、9.2g、9.5g、9.8gSl0g。
[0013] 在本發明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含冷凍保護劑60~ 180gJ^|^n60g、65g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g、150g、160g、170gSl80g。
[0014] 在本發明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含賦形劑180~ 300gjl^ni80g、185g、190g、195g、200g、210g、220g、230g、240g、250g、260g、270g、280g、 290g或300g。
[0015] 在本發明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含酶活保護劑5~ 12gj|^n5g、6g、7g、8g、9g、10g、llgSl2g。
[0016] 在本發明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含表面活性劑0.3 ~5gjl^n0.3g、0.4g、0.5g、0.7g、0.9g、lg、1.3g、1.5g、1.8g、2g、2.2g、2.5g、2.8gS3g。
[0017] 優選地，在本發明中，所述重組人透明質酸酶通過CH0表達的細胞上清液純化得 到。
[0018] 優選地，所述重組人透明質酸酶純度>95%，比活大于100000IU/mg。
[0019] 在本發明中，所述緩沖劑為磷酸鹽緩沖液。
[0020] 優選地，所述冷凍保護劑為蔗糖、海藻糖、麥芽糖或乳糖中的任意一種或至少兩種 的組合，優選為蔗糖和/或海藻糖。
[0021 ]優選地，所述賦形劑為甘露醇和/或甘氨酸，優選為甘露醇。
[0022]優選地，所述酶活保護劑為氯化鈉、氯化鈣或乙二胺四乙酸二鈉中的任意一種或 至少兩種的組合，優選為氯化鈣和乙二胺四乙酸二鈉的組合。
[0023] 優選地，以10000支計算，所述重組人透明質酸酶凍干制劑中氯化鈣的含量為1.2-2.48，例如1.28、1.38、1.58、1.78、1.98、28、2.18、2.28、2.38或2.4 8，乙二胺四乙酸二鈉含 量為 4.8_6.0gj|^n4.8g、4.9g、5g、5.2g、5.4g、5.6g、5.8g、5.9gS6g。
[0024] 優選地，所述表面活性劑為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或Triton X-100中的任 意一種或至少兩種的組合，優選為聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80。
[0025] 優選地，所述凍干制劑用注射用水溶解后，用于皮下或者靜脈注射。
[0026] 另一方面，本發明提供了如第一方面所述的重組人透明質酸酶凍干制劑的制備方 法，所述方法包括以下步驟：
[0027] A、重組人透明質酸酶、緩沖劑、冷凍保護劑、賦形劑、酶活保護劑和表面活性劑加 入至水中混合均勻，制備得到重組人透明質酸酶液體制劑；
[0028] B、將步驟A得到的重組人透明質酸酶液體制劑進行分裝，分裝后的制劑冷凍干燥 得到重組人透明質酸酶凍干制劑。
[0029]優選地，所述冷凍干燥過程為：
[0030] (1)在-2Γ ~-8Γ環境下，例如在-2Γ、-3 Γ、-4Γ、-5Γ、-6Γ、-7Γ或-8Γ，預凍 0.5~lhj|^n0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9hSlh;
[0031] (2)在-35Γ ~_4(TC 環境下，例如在 _35。(：、-36。(：、-37。(：、-38。(：、-39。(：或-40。(：，預 凍2 ~4h，例如 2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h、3.3h、3.5h、3.7h、3.9hS4h;
[0032] (3)在-15Γ ~-3(TC，例如-20Γ、-2Γ(：、-22Γ、-23Γ、-24Γ、-25Γ、-26Γ、-27 °C、-28°C、-29°C或-3CTC，10~20mbar環境下，例如lOmbar、1 lmbar、12mbar、13mbar、 14mbar、15mbar、16mbar、17mbar、18mbar、19mbar 或 20mbar，干燥 15~25h，例如 15h、16h、 17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24hS25h;
[0033] (4)在-5Γ ~1(TC，例如-5Γ、-4Γ、-3Γ、-2Γ、-Γ(：、(Τ(：、Γ(：、2Γ、3Γ、4Γ、5Γ、 6°C、7°C、8°C、9°C或 10°C，10~20mbar環境下，例如lOmbar、1 lmbar、12mbar、13mbar、 14mbar、15mbar、16mbar、17mbar、18mbar、19mbar 或 20mbar，干燥0 · 5 ~3h，例如0 · 5h、0 · 7h、 0.9h、lh、1.3h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8hS3h;
[0034] (5)在15Γ ~3(TC，例如15Γ、16Γ、17Γ、18Γ、1%~、20Γ、22Γ、24Γ、26Γ、28 °C、29°C或3CTC，10~20mbar環境下，例如lOmbar、llmbar、12mbar、13mbar、14mbar、15mbar、 1611^&1'、1711^&1'、1811^&1'、1911^&1'或2〇11^&1'，干燥5~15]1，例如5]1、6]1、7]1、8]1、9]1、1〇]1、11]1、 12h、13h、14h或15h。
[0035] 另一方面，本發明提供了所述重組人透明質酸酶凍干制劑在制備促進手術及創傷 后局部水腫或血腫消散、促進局麻藥的浸潤、減輕注射部位的疼痛或者加速皮下注射或