預防和治療免疫病變和炎性疾病的包括用nod2激動劑處理的干細胞或其培養物的藥物組合物的制作方法
【專利說明】預防和治療免疫病變和炎性疾病的包括用N0D2激動劑處理的 干細胞或其培養物的藥物組合物
[0001 ]本申請是分案申請，原申請的申請日為2 0 1 1年8月1 9日、申請號為 201180045953.4、發明名稱為"預防和治療免疫病變和炎性疾病的包括用N0D2激動劑處理 的干細胞或其培養物的藥物組合物"。
技術領域
[0002]本發明涉及預防或治療免疫病變和炎性疾病的藥物組合物，其包括通過用N0D2激 動劑培養表達核苷酸-結合寡聚結構域蛋白2(N0D2)的干細胞產生的干細胞或其培養物。更 具體地，本發明涉及抑制對象的免疫應答或炎癥應答的方法，其包括向對象施用藥物組合 物、干細胞或其培養物的步驟;利用干細胞或其培養物制備免疫抑制藥物或抗炎藥物的方 法；制備PGE 2或TGF-βΙ的方法，包括在具有N0D2激動劑的培養基中培養N0D2-表達干細胞的 步驟;包括表達N0D2的干細胞和N0D2激動劑的移植物(graft);制備移植物的方法;包括表 達N0D2的干細胞和N0D2激動劑的復合物(composite);和通過用N0D2激動劑培養N0D2-表達 干細胞產生的培養物。
【背景技術】
[0003]屬于核苷酸-結合寡聚結構域(N0D)蛋白質家族的蛋白質由三個主結構域構成:在 N-末端上的參與蛋白質-蛋白質相互作用的半胱天冬酶募集結構域(CARD)或熱蛋白結構 域、中心N0D結構域和C-末端上的LRR結構域。N0D蛋白質的類型可分為在N-末端上具有一個 CARD結構域的N0D1組，和在N-末端上具有兩個CARD結構域的N0D2組。這兩組一起被稱為N0D 樣受體(NLR)，并且它們與Toll樣受體(TLR)-起顯著有助于體內免疫應答的發展。已知NOD 通過識別來自大多數細菌的細胞壁的PGN部分，在先天的免疫應答中起到極其重要的作用。 NOD 1在胃和結腸的上皮細胞和胰、肺、腎和脾的巨噬細胞和樹突細胞中表達。已知NOD 1識別 二氨基庚二酸(DAP)-型PGN干肽（stempeptide)、二肽或三肽，其存在于革蘭氏陰性菌和一 些革蘭氏陽性菌中，但在真核細胞中不存在(Hisamatsu T等，J.Biol.Chem. ,278:32962， 2003)〇
[0004] N0D2主要在髓樣細胞，特別是巨噬細胞、中性白細胞和樹突細胞中，以及小腸中的 帕內特細胞中表達，并且與N0D1相比，其分布更加受限。此外，N0D2的表達被炎性細胞因子 艮PTNF-α和IFN-γ誘導。因此，N0D2幾乎不在正常腸細胞中表達，而是僅當腸細胞被感染時 表達。在由N0D2識別的激動劑中最廣泛已知的激動劑(配體)為胞壁酰二肽(MDP )，其為對于 革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩者共有的肽聚糖（PGN)基序（Girardin SE，等， J.Biol.Chem.，278:8869,2003)〇
[0005] 2003年，Girardin，S. E.等報道了 N0D2-敲除小鼠可正常生長，但變得對通過口服 而不是靜脈內施用單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的感染高度敏感。 該結果提示N0D2不涉及生長機制，而是用作檢測MDP存在的模式識別蛋白。然而，在腸中李 斯特(Li steria)菌株的存在下，N0D2誘導抗菌活性的先天免疫應答，其起到體內防御蛋白 的作用(Girardin SE，等，J. Biol. Chem.，278:8869，2003) JDP已被用作刺激免疫應答的佐 劑，即抗原佐劑，和用作能夠輔助免疫原的佐劑（韓國專利申請公開號1019960033469、 1020070031848和1020100045473)。
[0006]同時，前列腺素 E2(在下文中，被稱為PGE2)是由前列腺素 E2:(5Z，ll(α)，13E，15S)-11，15-二羥基-9-氧-前列-5，13-二烯-1酸代表的化合物，并且是在生理和病理條件下最廣 泛產生的前列腺素 (Ushikubi F等，J.Pharmacol .Sci .83:279,2000)。
[0007] PGE2傳統上用于使子宮頸準備生產并且已經實際上用于刺激分娩的藥物組合物 中。它以陰道栓劑的形式制造，具有以下商標名稱：Cervidil (由Forest Laboratories， Inc·)、Prostin E2(由Pfizer Inc·)、Propess(由Ferring Pharmaceuticals)和Glandin (由Nabiqasim Pharmaceuticals Pakistan)。最近，PGE2已經被提示為新免疫抑制調節劑 的強有力的候選者，因為它起到抑制由巨噬細胞產生的細胞因子諸如白細胞介素_1β和TNF α的釋放并且同時抑制輔助Τ1細胞分化(Harris SG等，Trends Immunol. ,23:144,2002)。此 外，體外研究已經報道PGE2抑制細胞因子諸如白細胞介素-2和IFN-γ的產生，以便抑制人 和鼠科動物T細胞分化(Goodwin JS等，J. cl in. Immunol .，3:295，1983)。這些研究提示PGE2 為有希望的免疫調節藥物，并且因此已經非常需要開發其成本有效且簡單的生產方法。 [0008] 同樣地，已知轉化生長因子m(TGF-m)為免疫抑制藥和抗炎藥物。TGF-m，像pge2 一樣，已經被提示作為有希望的免疫調節藥物，并且因此已經非常需要開發其成本有效且 簡單的生產方法。
[0009] 同時，免疫抑制藥物的類型可分為特異性和非特異性免疫抑制劑。理論上，特異性 免疫抑制劑是較好的，但主要使用非特異免疫抑制劑。環孢霉素(Neoral，Cipol A)、咪唑硫 嘌呤(硫唑嘌呤)和潑尼松龍(類固醇)是在臨床實踐中最經常使用的免疫抑制藥物。已經發 現與單獨藥物的使用相比，這三種藥物的組合顯示較少的副作用和較高的免疫抑制作用。 最近，很多免疫抑制藥物諸如FK 506、1^了6、010'3、(^11(3印丨等已經被開發并用于臨床實踐。
[0010] 在從抗原刺激至抗體產生的過程中，這些免疫抑制藥物通過阻礙巨噬細胞對抗原 的吞噬加工、淋巴細胞的抗原識別、細胞分裂、T和B細胞的分裂或抗體產生引起免疫抑制。 多數藥物具有抗腫瘤活性，因為它們通過誘導DNA損傷、抑制DNA合成等阻礙細胞分裂。
[0011] 然而，藥物的代表性副作用為高血壓和中毒性腎損害（腎功能降低）。由于這些副 作用的高發生率，患者的狀況不得不被充分監測，以檢測副作用的發生。副作用諸如震顫、 抽搐、肝炎、膽汁郁積、血尿酸過多、肌無力、多毛癥和齦肥大很少出現。被稱為咪唑硫嘌呤 的一種經常使用的抑制劑抑制引起低白細胞計數、貧血癥和低血小板計數的骨髓功能。另 外，咪唑硫嘌呤可引起并發癥諸如胰腺炎、肝炎和膽汁郁積，以及偶爾地脫發和發熱。被稱 為潑尼松龍的類固醇藥物是市場中使用的第一個免疫抑制劑，并具有多種抑制活性。例如， 它可增加個體的食欲、肩膀和背部附近的肌肉量，并可引起暫時的精神愉快。然而，該類固 醇藥物應該被謹慎使用，因為它促進動脈粥樣硬化的進展，并引起高血壓、胃潰瘍、糖尿病、 生長阻滯、骨質疏松癥、白內障或青光眼。
[0012] 同種異體移植諸如器官移植和造血干細胞移植是21世紀中引人注目的醫學成就， 并且已經被應用于絕癥諸如心力衰竭一一包括擴張型心肌病、慢性腎衰竭和難治的血液病 的根治療法。然而，仍然具有克服同種異體移植后產生的致命并發癥，諸如移植物移入失敗 或移植物抗宿主病(GVHD)的限制。在使這些免疫應答最小化的努力中，已經使用用于控制T 細胞免疫應答的療法，該免疫應答由在移植后識別同種異體抗原的T細胞的細胞免疫引起 (Ikehara S，Exp.Hematol·，31:1142，2003;First MR，Transplantation，77:88，2004)，即， 通過利用免疫抑制藥物，環孢霉素或FK506抑制T細胞的白細胞介素（IL)-2產生控制免疫應 答的療法。然而，仍然非常需要開發沒有副作用的便宜免疫抑制藥物。
[0013] 同時，間質干細胞的免疫調節機制還沒有被完全鑒定，同時，對于間質干細胞，僅 少數研究被報道。第一發現是間質干細胞似乎抑制抗原呈遞細胞(APC)。免疫應答的變化與 在某些條件下的培養過程期間添加的單核細胞數成比例，這提示單核細胞參與免疫抑制。 第二發現是間質干細胞似乎通過調節T細胞增殖誘導免疫抑制性質。T細胞與間質干細胞的 共培養下調細胞周期蛋白D2的表達并隨后將T細胞停止在細胞周期的G0/G1期中，以預防它 們增殖。也報道了，甚至在間質干細胞被移出后，增殖能力也持續降低（Glennie S等， Blood,105:2821,2005)。
[0014] 公開內容
[0015] 技術問題
[0016] 在利用干細胞開發調節免疫或炎癥應答的更有效的方法的努力中，本申請人首先 發現N0D2受體在干細胞中表達，和干細胞經N0D2受體調節免疫應答。隨后，他們發現當干細 胞用N0D2激動劑即MDP處理時，PGE 2和TGF-βΙ被過度表達，這導致更有效地抑制免疫應答， 由此證明其對本發明完成的結腸炎和特應性皮炎模型的治療效果。
[0017]技術方案
[0018] 本發明的目的是提供預防或治療免疫病變或炎性疾病的藥物組合物，其包括通過 用N0D2激動劑培養表達N0D2的干細胞而產生的干細胞或其培養物，其作為常規免疫抑制藥 物和抗炎藥物的替代是便宜的并且不具有副作用。
[0019] 本發明的另一個目的是提供治療免疫病變或炎性疾病的方法，其包括向患有免疫 病變或炎性疾病的對象施用組合物的步驟。
[0020] 本發明的再一個目的是提供抑制對象的免疫應答或炎癥應答的方法，其包括向對 象施用干細胞或其培養物的步驟。
[0021] 本發明的再一個目的是提供制備免疫抑制藥物或抗炎藥物的方法。
[0022]本發明的再一個目的是提供制備在多種應用中使用的前列腺素 EdPTGF-m的方 法。
[0023]本發明的再一個目的是提供包括表達N0D2的干細胞和N0D2激動劑的移植物，或通 過將干細胞從移植物中移出而制備的移植物，和移植物的制備方法。
[0024]本發明的再一個目的是提供包括表達N0D2的干細胞和N0D2激動劑的復合物。
[0025]本發明的再一個目的是提供通過添加 N0D2激動劑至表達N0D2的干細胞而產生的 培養物。
[0026] 有利效果
[0027] 本發明提供了可用于預防或治療免疫病變和炎性疾病的藥物組合物。此外，本發 明提供了制備PGE2和TGF-βΙ的方法，其能以有成本有效的方式以高產率產生PGE 2和TGF-βΙ， 而不進行化學處理。本發明的藥物組合物是便宜的不具有副作用的細胞治療劑，其可被用 作先前已知的具有副作用的免疫抑制藥物和抗炎藥物的替代。因此，它可用于預防或治療 免疫病變--諸如包括克羅恩病(Crohn's disease)、類風濕性關節炎和特應性皮炎在內 的自體免疫疾病一一和炎性疾病。
【附圖說明】
[0028] 圖1 a顯示了說明在hUCB-MSC中TLR和NLR表達的mRNART-PCR結果，和圖lb至le顯示 了在用每個激動劑處理后IL-8表達和MSC增殖的水平；
[0029] 圖2為顯示在用每個激動劑處理后hUCB-MSC對MNC增殖的影響的圖；
[0030] 圖3為顯示用每個激動劑處理后hUCB-MSC培養物對MNC增殖(3a和3b)和脾細胞增 殖(3c)的影響的圖；
[0031]圖4顯示了用MDP單獨處理的間質干細胞(hUCB-MSC#618)培養物的抑制效果的比 較(A)和siRNA處理的結果(B);
[0032] 圖5顯示了用MDP單獨處理的間質干細胞(hUCB-MSC#620)的抑制效果的比較(A)和 siRNA處理的結果(B);
[0033]圖6a顯示了在用相應的激動劑處理每種受體后PGE2分泌的量，圖6b顯示了在用相 應的激動劑處理每種受體后C0X-2表達的水平，圖6c顯示了 C0X-