中藥當歸提取物在制備抗耐藥菌藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥領域，具體涉及中藥當歸提取物在制備抗耐藥菌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著抗生素的廣泛應用，微生物的耐藥強度越來越高、耐藥譜越來越廣，耐藥性形 成的速度與抗菌素滅菌能力成比例上升。耐藥性一旦產生，將會保持下去。抗生素的繼續使 用，只會為高耐藥菌株繼續提供選擇壓力，促進其復制、組構及共同享用耐藥基因，導致多 重耐藥菌株的加快形成。目前，抗生素耐藥性已經成為全球嚴重的公共衛生問題。
[0003] 我國每年因抗生素濫用導致800億元醫療費用增長，同時致使8萬病人因其不良反 應死亡。因為，不論疾患輕重、手術大小，都在使用抗生素、并且傾向于高效價抗生素和經常 大量盲目長時間聯合用藥、個別甚至在短期內用到4種以上的抗生素而導致新的耐藥菌株 不斷出現。有專家預言，我國可能率先進入"后抗生素時代"，即回到抗生素發現之前的時 代。
[0004] 我國擁有極其豐富的中藥和天然藥物資源，藥用植物近萬種，為新藥發現提供了 豐富的物質基礎和來源。而且，用中成藥替代抗生素進行抗菌、消炎，具有不良反應及副作 用相對較小、不產生耐藥性等優點。另一方面，世界醫學界已有40年的時間里沒有真正意義 上的新型抗生素誕生。因此，許多科研工作者不由自主地把目光集中在天然藥材"抗生素" 上。從傳統中藥資源中找到同樣有抗菌消炎療效的抗生素替代性產品，將能很好地解決抗 生素耐藥性這一世界難題。
[0005] 近年來，細菌群體感應(Quorum sensing，QS)系統已成為研究新型抗耐藥菌藥物 的重要靶標。QS是細菌細胞內或細胞間信號傳遞的一種方式，通過監控某些信號分子(又稱 自體誘導分子)如高絲氨酸內酯(3〇71-1101]10861'；[116 1301：0116,41)的濃度，來控制并協調整 個細菌群體行為，共同對周圍環境刺激做出反應，極大增強了整個細菌群體的生存能力。
[0006] 綠假單胞菌(P.aeruginosa)具有很強的在組織表面形成生物膜的能力，并且其QS 系統研究得也最為透徹，因此銅綠假單胞菌被選做本項目研究的模式菌。銅綠假單胞菌是 一種重要的條件致病菌，常常引起呼吸道感染、肺炎、泌尿道感染等醫院內感染，被認為是 病人在醫院期間發生感染的第三大致病菌，嚴重危害著人類的健康與生命。銅綠假單胞菌 高的內在抗藥性與其群體感應系統密不可分，該QS系統控制著包括生物膜、外毒素、彈性蛋 白酶、溶血素、綠膿菌素等幾乎所有致病因子的表達。這些致病因子決定了銅綠假單胞菌對 宿主的致病能力。其中，生物膜的形成和擴散是造成P.aeruginosa多重耐藥的一個重要機 制。美國國立衛生研究院(NIH)發布的一份權威調查報告指出，人類微生物感染有超過80% 是通過細菌生物被膜(Biofilm，BF)介導的。BF作為一種細菌群體行為，其分化與發育與細 菌群體感應密切相關。細菌群體感應系統完整的細菌可以形成發育和分化正常的、典型的 能對抗殺菌劑的生物膜，而細菌群體感應系統殘缺的的細菌則不能形成典型的生物膜，對 抗生素的抵抗力顯著下降，并且容易被沖洗掉以及對殺菌劑敏感。因此，通過猝滅控制細菌 生物膜形成和病原菌毒力因子表達的QS系統，因不直接抑制細菌生長、不會對細菌產生選 擇性壓力，將很有希望獲得作用于新靶點、不會使細菌產生耐藥性的群感抑制劑（QS inhibitors，QSI)〇
[0007] 當歸為傘形科藁本植物當歸Angelica sinenSis(01 iv)DieIs的干燥根莖，味甘， 性辛、溫，歸肝、心、脾經，具補血和血、調經止痛之功效。始載于《神農本草經》，列為中品，其 藥效獨特，歷來是醫家珍品，素有"十方九歸"之稱。系統查閱當歸的文獻發現，現代藥理和 臨床研究也表明當歸具有良好的抗菌抗炎作用，但是沒有發現其抗耐藥菌及其抑制細菌群 體感應系統的文獻報道。
【發明內容】
[0008] 本發明的首要目的在于提供當歸提取物制備抗耐藥菌藥物的用途，具體的為當歸 提取物制備抗耐藥銅綠假單胞菌藥物的用途，所述當歸提取物通過抑制細菌生物膜發揮其 抗菌和/或抗耐藥菌的效果，具體的所述當歸提取物進一步的使用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 進行萃取，獲得當歸提取物浸膏的氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層流份或其提取物大 孔吸附樹脂的乙醇水溶液洗脫部分。
[0009] 優選的所述提取浸膏采用回流提取或冷浸提取。
[0010] 優選的大孔吸附樹脂乙醇水溶液洗脫液依次為20%、50%、70%和95%的乙醇水 溶液。
[0011]更優選的當歸回流提取的溶劑為50 %-95%的乙醇溶液，當歸冷浸提取的溶劑為 甲醇。
[0012] 本發明的另一目的是提供一種當歸提取物的抗耐藥菌藥物組合物，所述藥物組合 物包含上述當歸提取物和藥學上可接受的輔料。
[0013] 優選的所述藥物組合物為口服制劑。
[0014] 更優選的所述口服制劑為膠囊劑、片劑和顆粒劑等。
[0015] 本發明的再一目的為提供一種抗耐藥菌的當歸提取物的制備方法，所述當歸提取 物采用當歸回流提取或冷浸提取，提取液進一步采用有機溶劑進行萃取或使用大孔吸附樹 脂進行乙醇溶液梯度洗脫制得。
[0016] 優選的有機溶劑為氯仿、乙酸乙酯、正丁醇；
[0017] 優選的進行大孔吸附樹脂梯度洗脫的乙醇溶液依次為20 %、50 %、70 %和95 %乙 醇水溶液。
[0018] 更優選的當歸回流提取的溶劑為50 %-95%的乙醇溶液，當歸冷浸提取的溶劑為 甲醇。
[0019] 具體的所述抗耐藥菌的當歸提取物按照以下回流提取、有機溶劑萃取或大孔吸附 樹脂梯度洗脫方法制備，具體的包括以下步驟：
[0020] (1)當歸干燥根粉碎，50 % -95 %乙醇回流提取2-3次，每次1-2小時，合并提取液；
[0021] (2)減壓濃縮提取液，得到乙醇浸膏；
[0022] (3)乙醇浸膏采用有機溶劑萃取或大孔吸附樹脂的梯度洗脫，即得有機溶劑萃取 流份和大孔吸附樹脂洗脫部分。
[0023] 優選的，步驟（1)采用60%-95%乙醇回流提取2-3次，更優選的為采用95%乙醇回 流提取2次，每次提取2小時，合并提取液。
[0024] 優選的當步驟(3)乙醇浸膏采用有機溶劑萃取時，其具體步驟為乙醇浸膏依次用 等體積的氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇分別萃取三次，分別減壓回收各萃取部分溶劑，得 到氯仿可溶部分(ASC)，乙酸乙酯可溶部分(ASE)，正丁醇可溶部分(ASB)，和水層(ASW)，即 得。
[0025] 優選的當步驟(3)采用大孔吸附樹脂梯度洗脫時，其具體步驟為進行大孔樹脂開 放柱層析，依次用體積百分比為20 %的乙醇水溶液、50%的乙醇水溶液、70 %的乙醇水溶 液、95%的乙醇水溶液洗脫大孔樹脂開放柱，得到各部分洗脫液，減壓回收各洗脫部分溶 劑，得到20 %乙醇水溶液洗脫部分，50 %乙醇水溶液洗脫部分，70 %乙醇水溶液洗脫部分和 95%乙醇水溶液洗脫部分，即得。
[0026]本發明的有益效果：
[0027] 本發明提供了當歸提取物的一種新的用途，實驗結果顯示本發明的當歸提取物及 其有機溶劑萃取流份和大孔吸附樹脂梯度洗脫部分可以抑制銅綠假單胞菌和耐藥銅綠假 單胞菌的生物膜，顯示了本發明當歸提取物及其有機溶劑萃取流份和大孔吸附樹脂梯度洗 脫部分對于銅綠假單胞菌的抑制效果，更突出的是本發明的當歸提取物及其有機溶劑萃取 流份和大孔吸附樹脂梯度洗脫部分對于耐藥銅綠假單胞菌同樣顯示了明顯的抑制作用，從 而提供了一種非抗生素類的抗耐藥菌藥物，并有助于避免抗生素耐藥問題。
【附圖說明】
[0028] 圖1為當歸提取物各萃取層對銅綠假單胞菌生物膜的吸光度值；
[0029] 圖2為當歸提取物及各溶劑萃取部分對銅綠假單胞菌生物膜的抑制活性的電子掃 描顯微鏡圖像。
【具體實施方式】
[0030] 下面將進一步的來舉例說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要 求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所 附權利要求書記載的內容為準。
[0031] 實施例1:當歸提取物的制備方法
[0032] (1)當歸干燥根10kg，粉碎，用10倍量當歸重量的95%乙醇回流提取3次，每次2小 時，合并提取液；
[0033] (2)減壓濃縮提取液，得到乙醇浸膏1700g。
[0034] (3)乙醇浸膏依次用等體積的氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇分別萃取三次；
[0035] (4)分別減壓回收各萃取部分溶劑，得到氯仿可溶部分(ASC)420g，乙酸乙酯可溶 部分(ASE)87g，正丁醇可溶部分(ASB)725g，和水層(ASW)356g。
[0036]實施例2:當歸提取物的制備方法
[0037] (1)當歸干燥根5kg，粉碎，用20倍當歸重量的甲醇冷浸，冷浸兩次，每次兩個星期， 合并冷浸液；
[0038] (2)減壓濃縮冷浸液，得到甲醇提取物800g;
[0039] (3)將甲醇提取物的水混懸液，進行大孔樹脂開放柱層析，依次用體積百分比為 20 %的乙醇水溶液、50 %的乙醇水溶液、70 %的乙醇水溶液、95 %的乙醇水溶液洗脫大孔樹 脂開放柱，得到各部分洗脫液；
[0040] (4)分別減壓回收各洗脫部分溶劑，得到20%乙醇水溶液洗脫部分236g，50%乙醇 水溶液洗脫部分125g，70 %乙醇水溶液洗脫部分183g，和95 %乙醇水溶液洗脫部分117g。 [0041 ]實施例3:當歸提取物的制備方法
[0042] (1)當歸干燥根3kg，粉碎，用8倍當歸重量的60%乙醇回流提取三次，每次2小時， 合并提取液；
[0043] (2)減壓濃縮提取液至無醇味，得到乙醇提取物的水混懸液。
[0044] (3)乙醇提取物的水混懸液進行大孔樹脂開放柱層析，依次用體積百分比為10% 的乙醇水溶液、30 %的乙醇水溶液、50 %的乙醇水溶液、70 %的乙醇水溶液、95 %的乙醇水 溶液洗脫大孔樹脂開放柱，得到各部分洗脫液；
[0045] (4)分別減壓回收各洗脫部分溶劑，得到10%乙醇水溶液洗脫部分8