含Merochlorin A結構的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及含Meroch 1 oriη A結構的化合物的一種新用 途，更具體涉及含Merochlorin A結構的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 埃博拉病毒(Ebola Virus，EB0V)是傳染病埃博拉出血熱的病原體，該出血熱于 1976年首次在扎伊爾發現，其高傳染性的爆發流行和高致死性很快引起了世界各國研究人 員的注意。埃博拉病毒具有極強的感染性，可引起人類和其他靈長類動物高致死性的出血 熱綜合征。研究表明，埃博拉病毒的所有組分對疾病的發展都有一定的促進作用，尤其是埃 博拉病毒的囊膜糖蛋白（Glycoprotein，GP)可與祀細胞發生吸附，進而進入祀細胞，在介導 病毒進入靶細胞過程中發揮重要作用。埃博拉病毒的囊膜糖蛋白被認為是決定埃博拉病毒 致病性一個重要因素，體外通過轉染編碼囊膜糖蛋白基因的質粒或腺病毒進入靶細胞，能 夠導致靶細胞的脫落，表明埃博拉病毒的囊膜糖蛋白具有細胞毒性，但是其機理不詳。可 見，抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白活性是抑制埃博拉病毒感染靶細胞的重要途徑。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題如何制備抗埃博拉病毒感染藥物。
[0004]為解決上述問題，本發明首先提供了含Merochlorin A結構的化合物在制備抗埃 博拉病毒感染藥物中的應用。
[0005] 所述抗埃博拉病毒感染藥物可為治療型抗埃博拉病毒感染藥物和/或預防型抗埃 博拉病毒感染藥物。
[0006] 含Merochlorin A結構的化合物在制備抑制埃博拉病毒侵染哺乳動物細胞的產品 中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0007] 所述哺乳動物細胞具體可為人細胞。所述哺乳動物細胞具體可為哺乳動物肝癌細 胞。所述哺乳動物細胞具體可為人肝癌細胞。所述人肝癌細胞具體可為HUH7細胞。
[0008] 含Merochlorin A結構的化合物在制備抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的活性的產 品中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0009] 上述應用中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可為al)或a2):
[00?0] al)氣基酸序列是序列表序列2所不的蛋白質；
[0011] a2)將al)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 得到的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關的蛋白質。
[0012] 上述任一所述的應用中，所述含Merochlorin A結構的化合物可為式（I)所示化合 物；
[0014] 為解決上述問題，本發明還提供了一種產品。
[0015] 本發明所提供的產品，其活性成分為含Merochlorin A結構的化合物;所述產品可 為如下bl)或b2)或b3):
[0016] bl)抗埃博拉病毒感染藥物；
[0017] b2)抑制埃博拉病毒侵染哺乳動物細胞的產品；
[0018] b3)抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的活性的產品。
[0019] 上述產品中，所述抗埃博拉病毒感染藥物可為治療型抗埃博拉病毒感染藥物和/ 或預防型抗埃博拉病毒感染藥物。
[0020] 上述產品中，所述哺乳動物細胞具體可為人細胞。上述產品中，所述哺乳動物細胞 具體可為哺乳動物肝癌細胞。上述產品中，所述哺乳動物細胞具體可為人肝癌細胞。所述人 肝癌細胞具體可為HUH7細胞。
[0021] 上述產品中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可為al)或a2):
[0022] al)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白質；
[0023] a2)將al)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 得到的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關的蛋白質。
[0024] 上述任一所述產品中，所述含Merochlorin A結構的化合物可為式（I)所示化合 物；
[0026] 上述任一所述埃博拉病毒可為扎伊爾亞型，具體為H. sapiens wt/GIN/2014/ Gueckedou-C07〇
[0027]由于高致病性和傳染性，本發明中所述埃博拉病毒可用埃博拉假病毒代替，所述 埃博拉假病毒的制備方法可如下：
[0028] 1、向質粒pcDNA? 4/Hi sMax的限制性內切酶BamHI和Xho I的識別序列之間插入核 苷酸序列是序列表中的序列1所示的雙鏈DNA分子，得到重組質粒pcDNA4-EB0V-GP。
[0029] 2、將重組質粒pcDNA4-EB0V-GP和pNL4.3-Luc-R-E-載體質粒共轉染HEK 293T細 胞，置于37°C、5%⑶2培養箱孵育6h，用PBS緩沖液沖洗2次，然后加入DMEM培養基，置于37 °C、5 % C02培養箱繼續孵育48h，收集細胞上清。
[0030] 3、取步驟2收集的細胞上清，3000rpm離心10min，收集上清液并用0.22μπι微孔濾膜 過濾，收集過濾后的液體。
[0031] 4、取步驟3過濾后的液體，30000rpm離心2.5h，獲得的沉淀用lmL DMEM培養基溶 解，得到所述埃博拉假病毒的病毒液。
[0032] 序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白為埃博拉病毒的扎伊爾亞型的 H. sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou_C07的囊膜糖蛋白。因此，含Merochlorin A結構的化 合物具有抑制具有序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的假病毒的能力，應該 也具有抑制扎伊爾亞型的埃博拉病毒的能力。扎伊爾亞型的埃博拉病毒具體可為 H.sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou_C07〇
[0033] 實驗證明，本發明提供的含Merochlorin A結構的化合物在埃博拉假病毒感染前 或感染后對埃博拉假病毒的感染均具有抑制作用。因此，本發明提供的含Merochlorin A結 構的化合物可抑制埃博拉病毒感染靶細胞，在制備抗埃博拉病毒感染藥物中具有重要的應 用價值。
【附圖說明】
[0034]圖1為埃博拉假病毒感染前給予化合物I對埃博拉假病毒感染HUH7細胞的抑制作 用。
【具體實施方式】
[0035]下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0036] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0038] HUH7細胞（人肝癌細胞）購自日本細胞庫（Japanese Collection of Research Bioresources，JCRB)，編號為JCRB0403。胎牛血清為Sera Pro公司產品。DMEM培養基為 Gibco公司產品。二甲基亞諷為Amresco公司產品。Luciferase Cell Culture Lysis 5X Reagent為Promega公司產品，貨號為E1531JEK 293T細胞為中國普通微生物保藏管理中心 (簡稱CGMCC)產品，產品目錄號為8.00020。質粒pcDNATM 4/HisMax為Life technologies公 司產品，貨號為V8642(KPBS緩沖液為BioTopped公司產品，貨號為top0027luciferase Assay System 10-Pack為Promega公司產品，貨號為E1501〇
[0039] ZMapp 2G4單克隆抗體的制備方法參考如下文獻：Q Xiangguo，W Gary，et al.Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp.Nature.2014,514(10):47-61.
[0040] pNL4.3-Luc-R-E-載體質粒購自BioVector中國質粒載體菌株細胞基因保藏中心-NTCC國家典型培養物保藏中心（網址為http: //www. biovector .net/)，貨號為3767994。 [0041 ]實施例1、埃博拉假病毒稀釋液的制備方法
[0042]由于埃博拉病毒的高致病性和傳染性，埃博拉假病毒能夠代替活病毒的部分研 究。本發明中使用的埃博拉假病毒的制備方法如下：
[0043] 1、向質粒pcDNA? 4/Hi sMax的限制性內切酶BamHI和Xho I的識別序列之間插入核 苷酸序列是序列表中的序列1所示的雙鏈DNA分子，得到重組質粒PCDNA4-EB0V-GP。重組質 粒pcDNA4-EB0V-GP表達序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白（Glycoprotein， GP)，以下間稱GP蛋白。
[0044] 2、將步驟1構建的重組質粒pcDNA4-EB0V-GP和pNL4.3-Luc-R-E-載體質粒共轉染 HEK 293T細胞（每1 X 106個HEK 293T細胞約轉染10yg重組質粒pcDNA4-EB0V-GP和10yg pNL4.3-Luc-R-E-載體質粒），置于37 °C、5 % C02培養箱孵育6h，用PBS緩沖液沖洗2次，然后 加入DMEM培養基，置于37°C、5 % C02培養箱繼續孵育48h，收集細胞上清。
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