一種用于胰島素精控釋放的雙響應雙交聯可注射水凝膠的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種用于胰島素精控釋放的雙響應雙交 聯可注射水凝膠的制備方法，本發明還涉及將該水凝膠作為藥物載體的應用。
【背景技術】
[0002] 糖尿病已經成為社會健康問題之一，嚴重威脅著人類的健康。預計到2030年，全世 界糖尿病患者數量將從2000年的1.71億上升至3.66億，成為本世紀最重要的健康問題之 一。目前，糖尿病的主要治療方法是胰島素注射。多次注射胰島素的確可以維持基礎的胰島 素水平，但這種治療方式給患者帶來了很大的負擔，包括注射時的痛楚，注射后短時間內的 低血糖效應，飲食的節制以及無止盡的醫院之行等。應糖尿病治療的需要，胰島素自我調節 給藥體系成為近幾年的研究熱點，其中生物降解高分子體系，尤其是生物降解"智能"水凝 膠，在藥物控制釋放領域具有十分重要的意義，引起了研究者們極大的關注。血糖濃度是臨 床上檢測和治療糖尿病的唯一標準，因此葡萄糖響應性體系在發展胰島素自我調節給藥系 統方面十分有用，為構筑人造胰腺提供了可能，在糖尿病的治療方面具有十分重要的應用 前景。
[0003] 胰島素釋放需要根據血液環境中葡萄糖濃度的改變，在正確的時間釋放出正確的 劑量，對凝膠載體的響應靈敏度和響應速度提出了更高的要求，即能夠響應環境葡萄糖濃 度的微小變化從而快速的引起較大物理化學性質、降解、溶液-凝膠轉變或形狀變化并釋放 出藥物。葡萄糖響應體系主要有三大類，包括葡萄糖氧化酶(GOx)、凝集素和苯硼酸基體系 [Macromol·Biosci，2009;9(9):864-868;Biomacromolecules，2009;10(6):1337_1345; Biomacromolecules，2009; 10(5): 1212-1216.]。葡萄糖氧化酶和凝集素為蛋白類化合物， 對環境要求比較苛刻，外界環境的變化可能會導致其失活，而苯硼酸及其衍生物在于對其 分子結構的設計，使之具有較低的葡萄糖響應pKa值。目前關于葡萄糖響應性體系的構筑主 要采用三大響應因素中的一個，而將其中兩個或兩個以上因素結合到一起，構筑葡萄糖響 應性體系的研究還未見報道，且研究主要集中在載藥體系的制備及其響應方式上，即如何 保持蛋白等物質的活性和對苯硼酸衍生物分子結構的設計上，而對于如何提高體系響應靈 敏度和響應速度的研究卻很少。
[0004] 在前期研究中，我們利用苯甲酰亞胺鍵構筑了pH/溫度雙敏感的可注射殼聚糖基 質水凝膠，該水凝膠可用于抗腫瘤藥物和胰島素的長效可控釋放，取得了較好的腫瘤治療 效果，并能使STZ高血糖大鼠的血糖濃度在一周內維持較低水平;苯硼酸改性殼聚糖具有雙 親性，能與多羥基化合物交聯形成水凝膠，在生理pH下能夠響應環境中葡萄糖濃度變化并 釋放出藥物，且通過改變高分子的接枝率能夠調節其葡萄糖響應性。初步研究表明，將亞胺 鍵和苯硼酸酯二者結合起來不影響其各自的葡萄糖響應性，這為設計高靈敏、快響應的凝 膠體系提供了基礎和新思路，即利用亞胺鍵和苯硼酸酯兩種動態鍵制備pH/葡萄糖雙敏感 可注射水凝膠，同時將葡萄糖氧化酶等生物活性分子通過二硫鍵等動態鍵引入到凝膠基質 中，構筑雙重葡萄糖響應體系。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術中的不足，結合前期工作的基礎，本發明的目的之一是提供一種用 于胰島素精控釋放的雙響應雙交聯可注射水凝膠的制備方法，目的之二是提供該水凝膠在 醫藥領域中的應用。
[0006] 本發明的目的之一通過以下技術方案實現：
[0007] 一種用于胰島素精控釋放的雙響應雙交聯可注射水凝膠的制備，包括以下步驟：
[0008] (1)將殼聚糖（簡稱CS)與3-羧基苯硼酸（簡稱PBA)反應，生成苯硼酸改性殼聚糖 (簡稱CSPBA);
[0009] (2)將步驟（1)中制備的苯硼酸改性殼聚糖（簡稱CSPBA)與葡萄糖氧化酶（簡稱 GOx)通過二硫鍵相連，生成CSPBA-GOx;
[0010] (3)將多聚糖通過氧化反應引入醛基官能團，生成氧化多聚糖；
[0011] (4)將CSPBA-GOx與高分子交聯劑反應，通過苯硼酸酯和亞胺鍵交聯形成水凝膠。
[0012] 進一步的，所述步驟(1)中，苯硼酸改性殼聚糖具有以下結構：
[0014] 其中，上述結構式中的R為Η或CH20H;R'為-NHC = 0或 R"為甲 9 基、乙基、丙基、丁基、乙烯基、鹵素、羥基、羥甲基、酯基中的一種;n = 9~200;
[0015] 所述步驟⑵中，CSPBA-GOx具有以下結構：
[0017] 其中，上述結構式中的R為Η或CH20H; R '為
基、乙基、丙基、丁基、乙烯基、鹵素、羥基、羥甲基、酯基中的一種。
[0018] 進一步的，所述步驟(4)中的高分子交聯劑為I/II組合、I/III組合、IIII、V中的一 種或幾種，其中，Ι、π、ιπ、ππ、ν具有以下結構式，
[0029] 其中，上述結構式中的R為酯基或酰胺基或醚基，R'為Η或CH20H; n = 9~150，m = 9 ~150，x = 10~500，y = 10~600〇
[0030]進一步的，所述步驟(4)中形成水凝膠的溫度為4°C~40°C，形成水凝膠的時間為 1S~lh，形成水凝膠時溶液的pH值為3~10; pH值可用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸二氫 鉀-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、巴比妥納-鹽酸、Tri s-HCl緩沖液、硼 酸-硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化納緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖 液、鹽酸、氫氧化鈉中的至少一種進行調節。
[0031] 進一步的，該水凝膠采用了苯硼酸和葡萄糖氧化酶兩種葡萄糖響應因素來構筑水 凝膠，同時感應外界環境中的葡萄糖濃度變化，分別引起體系中亞胺鍵和苯硼酸酯的可逆 反應，使水凝膠的雙交聯網絡結構發生改變并釋放出藥物，通過雙感應元(葡萄糖氧化酶和 苯硼酸基）和雙接受元（亞胺和苯硼酸酯）實現其對葡萄糖濃度變化的高靈敏度和快速響 應。
[0032] 本發明利用亞胺鍵和苯硼酸酯兩種動態鍵制備pH/葡萄糖雙敏感可注射水凝膠， 同時將葡萄糖氧化酶等生物活性分子通過二硫鍵等動態鍵引入到凝膠基質中，構筑雙重葡 萄糖響應體系，利用苯硼酸和葡萄糖氧化酶兩種葡萄糖響應因素同時感應外界環境中的葡 萄糖濃度變化，分別引起體系中亞胺鍵和苯硼酸酯的可逆反應，使水凝膠的雙交聯網絡結 構發生較大改變并釋放出藥物，通過雙感應元(葡萄糖氧化酶和苯硼酸基)和雙接受元(亞 胺和苯硼酸酯)實現其對葡萄糖濃度變化的高靈敏度和快速響應。
[0033] 本發明的目的之二通過以下技術方案實現：
[0034] -種用于胰島素精控釋放的雙響應雙交聯可注射水凝膠在生物醫學領域中的應 用，將藥物溶液和/或細胞分散液加入到CSPBA-GOx溶液中，將制備的水凝膠作為藥物或細 胞載體。
[0035]進一步的，將所述的水凝膠可以作為糖尿病藥物載體，可用于負載抗糖尿病藥物 如胰島素等，以形成載藥水凝膠，并依靠雙感應元(葡萄糖氧化酶和苯硼酸基)和雙接受元 (亞胺和苯硼酸酯)實現其對葡萄糖濃度變化的高靈敏度和快速響應，可以作為糖尿病治療 藥物(如胰島素)的自我調節藥物釋放載體。
[0036] 本發明所述的水凝膠也可以作為細胞載體，可同時負載藥物和細胞，形成水凝膠/ 細胞/藥物復合體，從組織修復和藥物治療兩個層面對糖尿病足病患者進行醫治。
[0037] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0038] 1、本發明以具有良好生物相容性、生物降解性和抑菌性的殼聚糖衍生物為基礎高 分子，利用亞胺鍵和苯硼酸酯兩種動態鍵制備pH/葡萄糖雙敏感可注射水凝膠，同時將葡萄 糖氧化酶等生物活性分子通過二硫鍵等動態鍵引入到凝膠基質中，減少活性物質流失的同 時保持了分子的生物活性。
[0039] 2、本發明采用雙重葡萄糖響應因素構筑高靈敏、快響應的凝膠體系，苯硼酸酯是 對葡萄糖濃度的第一重響應，pH敏感的亞胺鍵和葡萄糖氧化酶是第二重響應，通過雙感應 元(葡萄糖氧化酶和苯硼酸基)和雙接受元(亞胺和苯硼酸酯)精確控制胰島素釋放動力學， 實現其對葡萄糖濃度變化的高靈敏度和快速響應。
[0040] 3、本發明通過亞胺和苯硼酸酯兩種動態鍵構筑水凝膠，該水凝膠雙響應性的同時 動態凝膠還具有自修復性和可注射性，可通過注射的方式植入到病灶部位，避免了手術植 入的痛苦和繁瑣，并且有利于填充不規則的損傷部位。
[0041 ] 4、本發明中的水凝膠可以作為藥物和細胞載體，用于糖尿病藥物，如胰島素等，并 可同時負載各種治療所需細胞，形成藥物/細胞/水凝膠復合物，以實現藥物的協同治療和 細胞層面的修復治療。
[0042] 5、本發明的水凝膠其制備方法簡單、操作方便。
【具體實施方式】
[0043] 以下結合實施例對本發明進行詳細的描述，但不限于實施例所公開的內容。
[0044] 實施例1
[0045]基于苯硼酸/葡萄糖氧化酶改性殼聚糖(CSPBA-GOx)和聚乙烯醇/苯甲酰基聚乙二 醇(PVA/PEGCH0)雙響應雙交聯水凝膠的制備。
[0046] (l)CSPBA 的合成。
[0047] 將177mg 3-羧基苯硼酸、123.3mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入250ml圓底燒瓶， 加入60ml甲醇溶解，室溫下攪拌20min后，加入166.3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二 亞胺鹽酸鹽(EDC · HC1)和殼聚糖溶液(0.5g溶于60ml 0.3%HAc)，室溫下攪拌24h后，將反 應物轉移到截留分子量為12kDa的透析袋中，在去離子水中透析48h，每四小時更換一次水。 將透析后的樣品冷凍干燥，得到白色粉末狀的產物。改變3-羧基苯硼酸和殼聚糖的摩爾比， 可制備不同苯硼酸接枝率的CSPBA。
[0048] (2)CSPBA_G0x 的合成。
[0049] 稱取0.05g CSPBA溶于50ml去離子水中，加入3ml 3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基 琥珀酰亞胺酯（SPDP)的DMF溶液（lmg/ml)，室溫下反應4h，然后加入47.5mg葡萄糖氧化酶 (配成3mg/ml水溶液），繼續反應24h后，將反應物轉移到截留分子量為12kDa的透析袋中，在 去離子水中透析48h，每四小時更換一次水。將透析后的樣品冷凍干燥，得到白色粉末狀的 產物。改變SPDP和葡萄糖氧化酶的量，可制備不同酶含量的CSPBA-GOx。
[0050] (3)PEGCH0 的合成。
[0051] 稱取6.0g對醛基苯