橄欖的液體植物混雜物的抗炎應用
【專利說明】橄欖的液體植物混雜物的抗炎應用
[0001] 本發明涉及，源自壓榨含油橄欖植物所得的水（通常稱為植物水（vegetation water))或源自橄欖油研磨過程產生的殘余橄欖油渣的，富含多酚化合物(具體富含羥基酪 醇和3，4-DHPA-EDA)的天然植物混雜物在治療或預防血管生成和/或炎癥中的應用。
[0002] 具體地，所述血管生成和炎癥是病理性類型，例如維持腫瘤發育和腫瘤擴散或與 非腫瘤病理相關的血管生成和炎癥。
[0003] 血管生成是個體生長和發育過程期間發生的生理過程，其涉及從已存在的血管腔 隙形成新血管。
[0004] 血管生成過程還是各種病理性現象的特點，包括腫瘤。
[0005] 腫瘤(或瘤）團塊可自發生長和發育多達約1-2_3;然而，為了繼續生長，其必須確 保自身有必需的營養和氧氣供給，所以其需要形成自己的血管腔隙。
[0006] 腫瘤能分泌血管原性因子，例如VEGF(血管內皮生長因子）、bFGF(堿性成纖維細胞 生長因子)和roGF(血小板衍生生長因子），它們能促進血管發育。腫瘤分泌的血管原性因子 激活內皮細胞，其經響應開始增殖并分泌降解細胞基質和基底膜的物質（例如基質金屬蛋 白酶-MMP)，從而迀移并入侵周圍組織。隨后，內皮細胞經組織形成由周細胞（即圍繞新形成 的血管，并能改善血流并調節血管滲透性的收縮性細胞)穩定的管狀結構。
[0007] 源自腫瘤的血管不規則并且其特征為與"正常"血管不一樣的結構元素。例如，它 們的特征是缺乏周細胞、大膜孔以及顯著的血管擴張。這些特征會改變血管的滲透性和壓 力水平，并且還因此干擾了抗腫瘤藥物的遞送，這些藥物在隙間液體中分散而不接觸腫瘤， 因此無法行使其功能。
[0008] 考慮到血管生成在腫瘤發育、生長和轉移過程中的重要性，進行了目的在于鑒定 能阻斷腫瘤血管無規則發育并能改善藥物向腫瘤位置遞送的物質的大量研究。具體地，已 在鑒定能阻止血管異常發育的分子方面進行了大量嘗試；形成了稱為"血管阻止 (angioprevention)"的概念（即阻止腫瘤相關的血管生成）。
[0009] 這些分子中大部分是天然來源(或在一些情況中是合成類似物）。一種非常有趣的 示例是源自橄欖油的分子。
[0010] 事實上，已知心血管疾病和腫瘤的發病率在地中海飲食群體中顯著較低，這種飲 食基于對橄欖油的消耗。科學證據為橄欖油研究提供了顯著的動力，所述研究目的在于定 義其組成，尤其是鑒定具有醫學-藥學潛能的物質。
[0011] 引起特別興趣的橄欖油的一個特征是其含有高水平的多酚。這些化合物是植物源 性的天然抗氧化劑，其能抑制自由基的形成。
[0012] 橄欖油的有益特性引起了橄欖種植和橄欖油生產的大量增長，主要在意大利。因 此，橄欖油生產也伴隨副產物的大量增加，主要是植物水和殘渣，它們具有高度污染性，因 此對環境產生了顯著影響。
[0013] 在意大利，這些材料的處置于國家和地區水平上均受到嚴格管控，并且法律的實 施（11/1996的574號法案)使生產者產生了繁重的成本，他們無法從這些廢料中獲取任何價 值，但其中事實上富含具有高度藥學潛能的分子。
[0014]羥基酪醇(hydroxytyrosol)是植物水中所含的研究最多的多酸。其存在于植物水 和殘渣中，還通過橄欖苦苷的水解形成，后者是主要存在于橄欖樹葉子中的物質。
[0015] 近期研究證實羥基酪醇自身具有針對PC12細胞(嗜鉻細胞瘤性細胞系）的細胞保 護功能、在給予U937細胞(人骨髓單核細胞系）和C2C12細胞(小鼠成肌細胞系）時抗凋亡、在 誘導的骨髓瘤病例中抑制體內乳腺腫瘤增殖、在針對HL60和HL60R腫瘤細胞系(人早幼粒細 胞性白血病細胞系和其多藥物抗性衍生物）的研究中是化學預防劑，并且預防經前綜合征 和骨質疏松癥。
[0016] 此外，已證實體內給予羥基酪醇（即便以高濃度給予)沒有毒性作用。
[0017] 其他研究證實，當單獨給予橄欖苦苷時，其產生抗微生物活性，在結直腸腫瘤細胞 系、轉移性乳腺癌和ER陰性細胞系中具有抗腫瘤潛能，并且具有在細胞骨架水平改變細胞 穩定性的能力。
[0018] 雖然對植物水進行了許多研究，但仍需要鑒定可以使該廢產物的利用價值提高的 新特征，否則其對生產者來說只是徒增成本，還有害于環境。特別需要鑒定可使這些廢料發 揮余熱的新的營養和醫學-藥學性質。
[0019] 因此，發明人驚奇地發現植物水可以在體內和體外阻斷/防止血管生成和炎癥，特 別是病理血管生成和炎癥，例如支持腫瘤發育和擴散的那些血管生成和炎癥，或與非腫瘤 病理相關的血管生成和炎癥。
[0020] 具體地，申請人發現通過利用反滲透方式而集中經歷微過濾的植物水的滲透，可 獲得富含多酚化合物的植物混雜物，其能防止并阻斷血管生成和炎癥，尤其是病理性血管 生成和炎癥，例如與腫瘤相關的那些或與非腫瘤病理相關的那些，其作用方式比單獨地攝 取相同化合物（即通過純化技術從植物水和殘渣中分離的相同化合物)所能實現的作用更 有效。
[0021 ]該作用對人體健康，主要是血管阻止方面有特別優勢。事實上，就此而言，本發明 植物水濃縮物可以其自身使用或與其他抗腫瘤和抗血管生成和抗炎物聯用，例如以飲品的 形式，以治療或預防血管生成和炎癥，尤其是與腫瘤相關的病理學血管生成和炎癥或與非 腫瘤疾病相關的病理學血管生成和炎癥。
[0022]本發明的進一步優勢根據下述詳細描述而顯見，在所附附圖的輔助下進行說明， 其中：
[0023]-圖1顯示MTT試驗的結果，旨在評估在下述逐級稀釋物處理后的HUVE細胞增殖:A) 本發明的多酚濃縮物(樣品A009) ;B)空白（樣品A012) ;C)純化的羥基酪醇(HyT);和D)純化 的羥基酪醇空白（即乙醇-EtOH)。
[0024]-圖2顯示處理后24和48小時，用下述逐步稀釋物處理后的凋亡和HUVE細胞死亡試 驗的結果。A，C)本發明的多酚濃縮物(樣品A009);B，D空白（樣品A012)。
[0025]-圖3顯示處理后24和48小時，用下述逐步稀釋物處理后的凋亡和HUVE細胞死亡試 驗的結果。A，C)純化的羥基酪醇(HyT); B，D純化的羥基酪醇空白（即乙醇-EtOH)。
[0026]-圖4顯示用下述試劑處理后，基于評估HUVE細胞在基質膠中形成毛狀管型結構的 能力的形態發生分析:A)無血清培養基(SFM)，完全培養基(CTRL)，本發明多酚濃縮物(樣品 △009)的1:500和1 :250稀釋物，空白（樣品4012)的1:500和1:250稀釋物;8)無血清培養基 (SFM)，完全培養基(CTRL)，純化的羥基酪醇(HyT)的1:500和1:250稀釋物，純化的羥基酪醇 空白（即乙醇-EtOH)的1:500和1:250稀釋物。
[0027]-圖5顯示用下述試劑處理后HUVE細胞的趨化性試驗結果:A)完全培養基(CTRL)， 無血清培養基(SFM)，本發明多酚濃縮物(樣品A009)的逐步稀釋物，空白（樣品A012);B)完 全培養基(C+)，無血清培養基(SFM)，純化的羥基酪醇(HyT)的逐步稀釋物，純化的羥基酪醇 空白（即乙醇-EtOH)的逐步稀釋物。
[0028]-圖6顯示用下述試劑處理后HUVE細胞的化學侵襲（chemo invasion)試驗結果:A) 完全培養基(CTRL)，無血清培養基（SFM)，本發明多酚濃縮物(樣品A009)的逐步稀釋物，空 白（樣品A012) ;B)完全培養基(C+)，無血清培養基(C-)，純化的羥基酪醇(HyT)的逐步稀釋 物，純化的羥基酪醇空白（即乙醇-EtOH)的逐步稀釋物。
[0029]-圖7顯示氧化應激(測定為DCFH-DA+細胞的百分比）對H2O2處理后用下述試劑處理 的HUVE細胞的影響的結果:A)本發明多酚濃縮物(樣品A009)的逐步稀釋物和相應空白（樣 品A012) ;B)純化的羥基酪醇(HyT)的逐步稀釋物和相應空白（即乙醇-EtOH)。
[0030] -圖8顯示氧化應激(測定為DCFH-DA+細胞的百分比）對下述試劑預處理后再用H2O 2 處理的HUVE細胞的影響的結果:A)本發明多酚濃縮物(樣品A009)的逐步稀釋物和相應空白 (樣品A012);B)純化的羥基酪醇(HyT)的逐步稀釋物和相應空白（即乙醇-EtOH)。
[0031] -圖9顯示小鼠皮下移植的基質膠接種物的肉眼可見的比色測定分析結果，A)無處 理(僅基質膠），存在VTH-VEGF、TGF、HGF (陽性對照C+ )，存在VTH和本發明多酚濃縮物(樣品 A009)的1:500稀釋物以及相應空白（樣品A012) ;B)無處理(僅基質膠），存在VTH-VEGF、TGF、 HGF(陽性對照C+)，存在VTH和純化的羥基酪醇(HyT)的1:500稀釋物。
[0032]-圖10顯示圖9的移植的基質膠接種物中血紅蛋白的分析。
[0033]本發明涉及植物水或殘渣的含多酚化合物(優選羥基酪醇和3，4-DHPA-EDA)的植 物混雜物或濃縮物，其用于治療或預防血管生成和炎癥。
[0034] 優選地，所述血管生成和炎癥是病理性血管生成和炎癥，更優選腫瘤相關血管生 成和炎癥。或者，血管生成和炎癥可不與腫瘤關聯而與例如下述的病理關聯:風濕性疾病， 優選類風濕性關節炎和痛風；結直腸炎性疾病，優選克羅恩氏病、腸易激和腸潰瘍性綜合 癥;支氣管病理，優選支氣管慢性阻塞性肺病和哮喘;肝臟疾病，優選肝硬化和纖維化;前列 腺疾病，優選前列腺增生和急性/慢性前列腺炎;粘膜炎;皮炎或腫瘤前病變，例如乳腺、子 宮、肺或口部病變。
[0035]事實上，已驚人發現本發明的植物水和/或橄欖殘渣的濃縮物在預防腫瘤血管新 生（即血管生成)方面特別有效。相比正常血管，這些血管具有不同物理化學結構，并因此具 有不同生物學功能。它們有大量間隙且通常缺乏周細胞，因而具有不同的血管滲透性。該結 構通常導致許多藥物治療的失敗或困難，由于這些藥物遞送腫瘤通過所述血管期間損失于 間隙空間中，并因此不能到達靶標或不能以有效量到達靶標。抑制此類血管結構的形成可 使遞送至腫瘤的效果明顯更好，并因而可改善腫瘤治療。
[0036]植物水優選源自三階段（油、植物水和殘渣)和兩階段（油和殘渣+植物水)橄欖研 磨過程。優選地，研磨產生的植物水可用具有酸性pH(優選pH 3-5,優選pH 4-5,例如通過添 加強酸)并具有果膠溶解酶(即水解橄欖表皮的纖維素基質的酶)的溶液處理。
[0037]殘渣優選經棰打、稀釋和預過濾。殘渣優選具有0.5-1毫米(mm)的尺寸或截止值， 更優選約〇.7_。截止值的示例是振動篩選所獲得的那些。
[0038] 若需要，棰打的殘渣可溶解或分散于pH 3-5,優選pH 3.5-4的水性基質中