蟬花蟲草多糖在制備雞免疫增強試劑中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蟬花蟲草多糖在制備雞免疫增強試劑中的用途，屬于畜禽免疫佐劑領 域。
【背景技術】
[0002] 傳染病特別是病毒性傳染病，在全世界范圍內對畜牧業造成嚴重損失，接種疫苗 是目前控制傳染病最有效的手段。然而，養殖場雖然按免疫程序進行了嚴格的疫苗接種，但 在很多情況下，動物免疫之后仍然難以產生有效的免疫應答，致使傳染病不能完全被控制。 若注射疫苗的同時，配合應用適當的免疫增強劑可以輔助疫苗產生較好的免疫應答，提高 其免疫效力，從而提高疫苗免疫的效果。應用免疫增強劑成為目前提高疫苗免疫效果的重 要手段之一。現有研究表明，中藥及其有效成分能夠顯著提高疫苗的免疫效果，很多中藥及 其主要成分作為疫苗的免疫增強劑已開始在動物及人的臨床上使用。
[0003] 近年來，很多研究者從植物和真菌中提取了多糖，通過研究發現多糖具有增強免 疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等一系列生物學活性。據報道，多糖最主要的活性 是其免疫調節活性，其對機體的特異性和非特異性免疫功能均具有增強作用，主要體現在 能夠促進特異性抗體生成、促進淋巴細胞增殖、提高巨噬細胞系統的吞嚼能力、誘導細胞因 子的分泌、激活補體系統等方式提高機體的免疫功能。
[0004] 蝴花(Paecilomyces cicadae(Miq·)Samson)是我國傳統的名貴中藥材之一，又名 金蟬花、蟬花蟲草，由麥角菌科蟲草屬真菌蟬擬青霉寄生于蟬類若蟲的干燥復合體。現有研 究結果表明，蟬花與多種蟲草中的主要成分氨基酸種類相似，具有不同程度的補益作用 [2]。 蟬花含有多種營養物質，提取的多糖稱之為蟬擬青霉多糖、蟬花蟲草多糖。有研究表明，蟬 擬青霉多糖對老年大鼠免疫功能有調節作用、對大鼠免疫功能和血液生化功能等具有一定 的作用。
【發明內容】
[0005] 本發明從人工培養蟬花蟲草中提取多糖，通過給雞灌服不同濃度的蟬花蟲草多 糖，以雞新城疫弱毒苗、滅活苗刺激，觀察不同處理對疫苗免疫后雞新城疫抗體變化水平的 影響，發現蟬花蟲草多糖可增強雛仔雞機體的免疫功能，而且免疫作用的時間持續較長。
[0006] 本發明的第一個目的在于提供蟬花蟲草多糖在制備雞免疫增強試劑中的用途，其 特征在于:所述蟬花蟲草多糖免疫增強劑由蟬花蟲草熱回流提取后經陶瓷膜分離純化制 成，具體步驟如下：（1)將蟬花蟲草粉碎過60~80目篩；向粉碎的原料中加入10倍體積的 50%乙醇，進行熱回流輔助提取，過濾，濾渣重復進行上述步驟，重復1~3次；合并多次濾 液；（2)70°C減壓濃縮至原體積的十分之一，得濃縮液；（3)將濃縮液在攪拌下加入3倍體積 的95%乙醇，靜置4小時以上，離心收集沉淀；用3倍體積的乙醇洗滌沉淀，離心，真空干燥得 到深褐色粉末狀的蟬花蟲草多糖；（4)經孔徑為50納米與200納米的陶瓷膜分離得到多糖分 子分子量為30-lOOw之間的粗多糖溶液，對粗多糖用sevage法除蛋白、脫色、過陰離子交換 柱后減壓濃縮得到的濃縮液；（5)將濃縮液進一步過sephadrose 6b凝膠樹脂純化，得到分 子量大小在75W左右的目的多糖，經真空干燥、滅菌、獲得蟬花蟲草多糖。
[0007] 進一步地，步驟（1)中蟬花蟲草可以是天然蟬花或人工栽培的蟬花蟲草子實體、蟬 花蟲草菌絲體或蟬花蟲草培養基。
[0008] 市售的免疫增強劑制備過程復雜，作用效果不確切，免疫作用時間不長。本發明蟬 花蟲草多糖能有效地促進雛雞生長性能及免疫機能的提高，增強了雛仔雞機體的免疫功 能，而且免疫作用的時間持續較長，蟬花蟲草多糖組成的免疫增強劑是一種安全有效的綠 色環保型免疫增強劑。
[0009] 本發明針對當前動物疫病防控現有技術中急需高效、安全的免疫增強劑或疫苗佐 劑的問題，提供一種由蟬花提取得到的多糖制成的新型中藥免疫增強劑。
[0010] 本發明的蟬花蟲草多糖免疫增強劑不同劑量對雞新城疫苗免疫效果的免疫增強 作用，證明合適的劑量能顯著提高免疫雛雞的血清抗體效價，增強雞的細胞免疫和體液免 疫，提高新城疫苗的免疫應答;100mg/kg · BW為雛雞的最佳劑量。
[0011] 另一方面，本發明提供一種雞免疫制劑，其特征在于，所述雞免疫制劑包括蟬花蟲 草多糖和至少一種雞的疫苗試劑，所述蟬花蟲草多糖免疫增強劑由蟬花蟲草熱回流提取后 經陶瓷膜分離純化制成，具體步驟如下：（1)將蟬花蟲草粉碎過60~80目篩；向粉碎的原料 中加入10倍體積的50%乙醇，進行熱回流輔助提取，過濾，濾渣重復進行上述步驟，重復1~ 3次;合并多次濾液；（2) 70 °C減壓濃縮至原體積的十分之一，得濃縮液；（3)將濃縮液在攪拌 下加入3倍體積的95%乙醇，靜置4小時以上，離心收集沉淀；用3倍體積的乙醇洗滌沉淀，離 心，真空干燥得到深褐色粉末狀的蟬花蟲草多糖；（4)經孔徑為50納米與200納米的陶瓷膜 分離得到多糖分子分子量為30-lOOw之間的粗多糖溶液，對粗多糖用sevage法除蛋白、脫 色、過陰離子交換柱后減壓濃縮得到的濃縮液；（5)將濃縮液進一步過sephadrose 6b凝膠 樹脂純化，得到分子量大小在75W左右的目的多糖，經真空干燥、滅菌、獲得蟬花蟲草多糖。
[0012] 與現有技術相比，本發明優點如下：
[0013] 1.與化學佐劑相比，蟬花蟲草多糖增強劑來源于天然中藥，成分安全，無毒副作 用，無藥物殘留隱患，可保障動物源食品安全且生產、制備過程對環境無污染，是一種綠色 高效的免疫增強劑。
[0014] 2.與傳統中藥方劑相比，蟬花蟲草多糖增強劑成分明確，質量可控，藥效可靠。
[0015] 3.與同類中藥成分方劑相比，蟬花蟲草多糖增強劑功效提高，單用或配合新城疫 疫苗免疫雛雞，能顯著增強細胞免疫和體液免疫，提高疫苗的免疫應答，可在獸醫臨床上推 廣應用。
【附圖說明】
[0016] 圖1:14日齡雛雞ND-HI抗體水平示意圖。
[0017]圖2:脾臟組織形態學染色（100X)。
[0018]圖3:法氏囊組織形態學染色（100X)。
【具體實施方式】
[0019]實施例1.蟬花蟲草多糖單一組分的分離純化
[0020] 1.1蟬花蟲草多糖的提取制備
[0021] 將蟬花蟲草粉碎過60~80目篩；向粉碎的原料中加入10倍體積的50%乙醇，進行 熱回流輔助提取，過濾，濾渣重復進行上述步驟，重復1~3次;合并多次濾液。70°C減壓濃縮 至原體積的十分之一;上述濃縮液攪拌下加入3倍體積的95 %乙醇，靜置4小時以上，離心收 集沉淀；用3倍體積的乙醇洗滌沉淀，離心，真空干燥得到深褐色粉末狀的蟬花蟲草多糖產 品。
[0022] 1.2蟬花蟲草多糖的分離純化
[0023] 蟬花蟲草多糖提取制備過程中最后一步用3倍體積的乙醇洗滌得到的多糖沉淀用 適量去離子水稀釋溶解至一定體積，將稀釋溶解蟬花蟲草多糖的溶液加到陶瓷膜分離機 中，先利用截留能力為200納米的陶瓷膜，將我們先前加入到陶瓷膜分離機中的蟬花蟲草多 糖溶液分離成兩部分，即200納米陶瓷膜的截流液A(多糖分子直徑大小大于200納米)與透 過液B(多糖分子直徑大小小于200納米），再將200納米陶瓷膜的透過液加入陶瓷膜分離器 中，利用截留能力為50納米的陶瓷膜，將我們加入到陶瓷膜分離機中的蟬花蟲草多糖溶液 分離成兩部分，即50納米陶瓷膜的截流液C(多糖分子直徑大小大于50納米)和透過液D(多 糖分子直徑大小小于50納米），最終通過兩次過膜，我們將原本的蟬花蟲草多糖溶液按多糖 分子直徑大小分成了三部分，分別是:多糖分子直徑大小大于200納米的溶液A、多糖分子直 徑大小在50納米與200納米之間的溶液C和多糖直徑大小小于50納米的溶液D。將溶液C用 sevage法除蛋白、脫色后減壓濃縮，進一步過sephadrose 6b凝膠柱純化，得到分子量大小 在75W左右的目的