白細胞介素35在制備抗病毒藥物的用圖
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于醫藥技術領域，涉及白細胞介素35(interleukin-35，IL-35)的藥物新 用途，具體是其在制備抗病毒藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 白細胞介素-35是IL-12家族的新成員，由IL-27的β鏈EBI3(EB病毒誘導基因3)和 IL-12的α鏈P35組成，最早在BJAB B淋巴細胞、C0S7細胞及胎盤滋養層細胞中發現分泌型的 EBI3及p35,2007年，研究人員在分子水平上將EBI3和p35通過3xGGGGS的柔性結合肽段連接 起來，并命名為IL-35JL-35的受體是由IL-12Ri32和gpl30組成的異源二聚體，或他們各自 形成的同源二聚體。在過敏性哮喘、多發性硬化癥、結節病等疾病中發現IL-35的表達。
[0003] I型干擾素包括IFNa、IFNP、IFN-δ、IFN-ε、IFN-δ、IFN-K、IFN-v、IFN-τ、和IFN- ω。I 型干擾素運用兩條信號通路，Toll樣受體(TLRs)和胞衆受體(cytosolic receptor)。1型干 擾素有多種功能，例如抗病毒、抑制細胞生長和免疫調節作用。III型干擾素 （Type III interferon，IFNs)，是一個新型的干擾素家族，坐落在第19號染色體ql3上，包括3種λ干擾 素：IFN-A1 (也被稱為 IL-29)、IFN-X2(也被稱為 IL-28A)和 IFN-X3(也被稱為 IL-28B)<JII 型 干擾素的信號轉導與I型干擾素類似，激活Jak/STAT信號通路，轉錄多種IFN相關的基因。 III型干擾素的抗病毒功能與I型干擾素相比較弱，而且只能針對某些病毒種類，如甲型流 感病毒、VSV、腦心肌炎病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒等。III型干擾素抑制病毒的復制保 護宿主細胞免于病毒感染。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供IL-35在制備抗病毒藥物中的應用。
[0005] 本發明證明IL-35具有抗病毒作用。通過探討流感病毒感染后誘導IL-35上調表 達，促進I型和III型干擾素表達的抗病毒作用機制；以及IL-35的廣譜抗病毒功效。
[0006] 為了實現上述任務，本發明采用以下技術方案：
[0007] IL-35在細胞和分子水平上對流感病毒復制有抑制作用，預示IL-35可以做為臨床 抗病毒藥物而進一步研究開發。首先我們在季節性流感病人的臨床樣本包括血液PBMC和咽 拭子中發現了 IL-35的高表達，且與流感病毒呈正相關。然后我們在A549細胞、人外周血淋 巴細胞和人肺泡二型原代細胞系中，發現A型流感病毒感染時誘導IL-35在mRNA和蛋白水平 上的高表達。IL-35過表達或外源的rhIL-35都能激活I型和III型干擾素的表達，以及干擾 素誘導基因 PKR、0AS、Mx的表達進而抑制病毒的復制，對包括EV71、VSV、IAV等病毒都具有抑 制病毒復制的作用。總體實驗首次發現了 IL-35能促進免疫細胞產生干擾素且激活下游通 路而達到廣譜抗病毒效果的機制。
[0008] IL-35作為一種新的細胞因子，在多種疾病中發現有表達，其機制及與疾病的相互 關系將不斷被發現。本發明揭示了 IL-35的一種新的生物學功能，能夠誘導免疫細胞產生干 擾素且激活干擾素下游通路進而發揮廣譜抗病毒的作用，這一新發現為研制抗病毒藥物提 供理論基礎。
[0009]本發明作為開發一種新的抗病毒因子IL-35的方法，具有以下優點和效果：
[0010] 本發明采用體內天然存在的蛋白IL-35，促進人體免疫細胞產生IFNa、正婦和正似 1，具有完備的生物學功能，且不用引入異源性的成分因而不會導致機體產生毒副作用。
【附圖說明】
[0011] 圖I: IL-35在A型流感病人臨床樣本中高表達
[0012] A.Real-time PCR檢測健康人和IAV病人血液PBMC中IL-35/EBI3mRNA(左）和IL-35/p35mRNA(右）；
[0013] B.Real-time PCR檢測健康人和IAV病人咽拭子中IL-35/EBI3mRNA(左）和IL-35/ p35mRNA(右）；
[0014] C.Pearson's correlation assay分析IAV病人血液PBMC中IL_35/EBI3mRNA與IAV NP mRNA相關性(左)和IL-35/p35mRNA與IAV NP mRNA相關性(右）。
[0015] 圖2:1六￥誘導幾-35在多種細胞中表達
[0016] A.不同劑量IAV感染A549細胞，24h后收集細胞樣，Real-time PCR檢測IL-35mRNA;
[0017] Β· IAV(MOI = I)感染A549細胞，收集他、611、1211、2411、4811細胞，1^31-衍1116?0?檢測 IL-35mRNA；
[0018] C.mock、滅活的IAV，IAV(MOI = I)感染A549細胞，24h后收集細胞，Real-time PCR 檢測 IL-35mRNA;
[0019] D. IAV(MOI = I)感染A549細胞，24h后收集細胞上清，ELISA檢測IL-35蛋白；
[0020] E .mock、滅活的 IAV，IAV(M0I = 0· 1)感染 PBMC 細胞，12h 后收集細胞，Real-time PCR 檢測 IL-35mRNA;
[0021 ] F .mock、IAV(M0I = 1)感染AT-II細胞，24h后收集細胞，Real-time PCR檢測IL-35mRNA〇
[0022] 圖3:pCMV-IL-35的構建和鑒定
[0023] A ·通過PCR技術將EBI3和p35連接插入pcDNA3 · 1 (-)載體上，構成pCMV-IL-35;
[0024] 8.?〇1^-11^-35電轉了虹1^七細胞，1^&1-^1116?0?檢測11^-35/^813和11^-35/ p35mRNA；
[0025] C. IL-35ELISA試劑盒檢測B中培養上清的IL-35蛋白；
[0026] D·293細胞轉染pCMV-IL-35，Westernblot分別用EBI3和p35的一抗檢測胞內IL-35蛋白。
[0027] 圖4: IL-35誘導I型和III型干擾素表達
[0028] A. Jurkat細胞分別轉染vector和pCMV-IL-35，24小時后收集Jurkat細胞，提取 RNA，Real-time 檢測 IFNa、IFNP 和 IFNAl 的 mRNA;
[0029] B. PBMC細胞分別轉染vector和pCMV-IL-35，24小時后收集PBMC細胞，提取細胞內 總 RNA，Real-t ime 檢測 IFNa、IFNP 和 IFNAl 的 mRNA;
[0030] C. Jurkat過表達pCMV-IL-35或vector 36小時，收集上清液，孵育A549細胞12小 時，加 IAV (MO I = 1)感染12小時，收集細胞樣檢測PKR、OAS、Mx的mRNA;
[0031] D.同E實驗，感染24小時，western blot檢測胞內PKR、0AS、Mx的蛋白表達;E.rhIL- 35刺激Jurkat細胞，不同時間點收集細胞，Real-time檢測IFNa、IFN0和IFNAl的mRNA;
[0032] F .mock或rhIL-35刺激Jurkat細胞24h，收集上清液，孵育A549細胞12小時，加 IAV (MOI = I)感染24小時，western blot檢測胞內PKR、0AS、Mx的蛋白表達。
[0033] 圖5: IL-35通過Jurkat細胞間接抗病毒
[0034] Jurkat細胞分別轉染pCMV-IL-35和Vector，36小時后離心收集上清做抗病毒實 驗。
[0035] A.A549細胞用Jurkat上清孵育 12小時，加入IAV(M0I = I)，Real-time PCR檢測胞 內IAV三種RNA;
[0036] B.血凝實驗檢測上清中IAV的滴度；
[0037] C·RD細胞，用Jurkat上清孵育 12小時，加入EV71 (Μ0Ι = 1 )，Real-time PCR絕對定 量檢測EV71的拷貝數；
[0038] D · A549細胞用Jurkat上清孵育12小時，加入重組病毒VSV-eGFP(M0I = 1)，熒光顯 微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達；
[0039] E.流式細胞技術檢測E中GFP陽性的細胞。
[0040] 圖6: IL-35通過PBMC間接抗病毒
[00411 PBMC分別轉染pCMV-IL-35和Vector，36小時后離心收集上清做抗病毒實驗。
[0042] A·A549細胞用PBMC上清孵育12小時，加入IAV(M0I = I)，Real-time PCR檢測胞內 IAV 三種 RNA;
[0043] B.血凝實驗檢測上清中IAV的滴度；
[0044] C·RD細胞，用PBMC上清孵育12小時，加入EV71(Μ0Ι = 1 )，Real-time PCR絕對定量 檢測EV71的拷貝數；
[0045] D · Vero細胞用Jurkat上清孵育12小時，加入重組病毒VSV-eGFP(M0I = 1)，流式細 胞技術檢測GFP陽性的細胞。
[0046] 圖7: rhIL-35的抗病毒作用
[0047] 以100ng/ml rhIL-35或對照DMSO刺激Jurkat細胞24小時，收集上清進行抗病毒實 驗。
[0048] A.RD細胞，用Jurkat上清孵育 12小時，加入EV71(M0I = l)，Real-time PCR 絕對定 量檢