Lf-HA-DOX大分子前藥復合物及其構建方法和在治療神經膠質瘤中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物載體領域，具體涉及一種既可以通過血腦屏障，又能雙重靶向作用于神經膠質瘤的載體Lf-HA-DOX大分子前藥復合物及其構建方法和應用。
【背景技術】
[0002]膠質瘤是最常見和惡性程度最強的原發性顱內腫瘤。但是由于其彌漫浸潤性生長以及對放化療的抵抗，膠質瘤很難被傳統的治療方式完全治愈。因此，神經膠質瘤的臨床治療仍是一個需要研究和探索的難題。
[0003]傳統的化療失敗的一個重要原因是因為血腦屏障的存在導致抗腫瘤藥物很難達到腦實質。而傳統的載體，包括納米載體，不具有透過血腦屏障的能力，這嚴重限制了其在膠質瘤中的應用。另外，膠質瘤有大多數腫瘤共有的特性，如低pH，低p02等。這也導致傳統載體在腫瘤部位釋放藥物受限。因此，研究者們一直在尋找可以通過靜脈給藥途徑進入腦并且對pH敏感的藥物載體。
[0004]透明質酸(hyaluronic acid，HA)是⑶44受體的一個重要的配體，而⑶44在包括膠質瘤在內的多種腫瘤中均是高表達，由此以HA為骨架的運輸系統可以用于抗腫瘤治療。受體介導的轉胞吞作用(Receptor-mediated transcytosis，RMT)是藥物載體通過血腦屏障的一種轉運途徑。內皮細胞上有很多種這樣的轉運受體，如:轉鐵蛋白受體，胰島素受體，月旨蛋白受體。乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)是轉鐵蛋白中一員，其受體(Lf receptor，LfR)屬于低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein,LRP)。之前已有多項研究顯示Lf可以通過LRP介導的轉胞吞作用運輸到大腦，另外有些研究顯示LfR在血腦屏障上高表達。而且有研究顯示Lf對于血腦屏障的通透性明顯優于轉鐵蛋白。而且，LfR不僅在血腦屏障中高表達而且在膠質瘤細胞表面高表達。因此，Lf可以成為一種有效的血腦屏障和膠質瘤雙靶向配體。
[0005]阿霉素(Doxorubicin，D0X)是一種非常好的廣譜的抗癌藥物，已經廣泛用于抵抗多種實體腫瘤。但是由于其差的靶向性以及嚴重的副作用，尤其是心肌毒性，所以其在顱內腫瘤中的應用是有限的。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于根據目前用于治療神經膠質瘤的藥物難以通過血腦屏障、腦內局部注射法在臨床應用中存在困難等諸多缺陷，提供一種可以通過靜脈給藥的、既可以透過血腦屏障，又對神經膠質瘤具有靶向性作用，且對pH有響應性的Lf-HA-DOX大分子前藥復合物，該復合物可以安全有效的治療神經膠質瘤。
[0007]本發明另一目的在于提供上述Lf-HA-DOX大分子前藥復合物的構建方法。
[0008]本發明還有一個目的在于提供上述Lf-HA-DOX大分子前藥復合物在制備治療神經膠質瘤藥物中的應用。
[0009]本發明上述目的通過以下技術方案予以實現:
[0010]Lf-HA-DOX大分子前藥復合物，是以乳鐵蛋白Lf作為靶向修飾的配體，以阿霉素DOX作為神經膠質瘤的治療藥物，以透明質酸HA作為載體骨架得到的大分子前藥。本發明所述Lf-HA-DOX大分子前藥復合物具有雙重靶向性，具體是指乳鐵蛋白和透明質酸兩種分子通過受體介導轉運將藥物遞送至腦內。所述透明質酸骨架本身也具備腫瘤靶向性，能與腫瘤細胞表面高表達的CD44受體特異性結合，通過受體介導轉運的胞吞作用，增加藥物病灶區的富集濃度，達到腫瘤靶向的目的。該復合物的構建方法是本發明的關鍵。
[0011 ]本發明所述Lf-HA-DOX大分子前藥復合物的具體構建方法如下:
[0012](I)含肼基透明質酸(HA-ADH)的制備:稱取HA(分子量6500)溶于去離子水中，加入過量的己二酸二酰肼ADH，攪拌使其溶解，用HCl調節反應液pH至6.8。稱取等摩爾量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC.HCl及1-羥基苯并三唑(HOBt)，溶于DMSO與水的混合溶液中(1:1，v/v)，并將其滴入上述反應液中，室溫下反應12?24h。反應結束后，調節溶液pH至7.4，在去離子水中透析3-5d(截留分子量為6000)，凍干得HA-ADH;
[0013](2)稱取HA-ADH于三口燒瓶中，加入去離子水在氮氣氛圍下攪拌使之溶解，加入冰乙酸調節PH至5，稱取鹽酸阿霉素加入其中，待其溶解后，繼續通氮氣0.5?4h，密封，避光繼續在室溫反應12?24h。反應結束后，將反應液滴入大量的無水乙醇中沉淀，抽濾，固體用無水乙醇洗滌后干燥24?48h得產物透明質酸-阿霉素大分子前藥(HA-DOX);
[0014](3)透明質酸-阿霉素大分子前藥(HA-DOX)在0.1M的MES緩沖液(pH=5)中溶解，稱取等摩爾量的EDC和NHS加入，待其溶解后，再繼續反應0.5?2h，用0.1M NaOH調節pH至7，加入乳鐵蛋白，室溫反應12?24h。反應結束后，將反應液轉移至截留分子量為10000的透析袋中透析3?5d。將透析后的溶液凍干得到乳鐵蛋白修飾的透明質酸-阿霉素大分子前藥復合物(Lf-HA-DOX)。
[0015](4)采用凝膠電泳法，確證Lf與透明質酸(HA)的偶聯反應是否成功。
[0016]采用免疫熒光法觀察對U87細胞(人惡性膠質母細胞瘤細胞)和C6細胞(大鼠神經膠質瘤細胞)表面CD44受體表達進行了情況驗證，CD44受體是一種跨膜糖蛋白，由細胞外、跨膜及膜內三部分組成，透明質酸(Hyaluronic acid，HA)通過與⑶44受體的特異性結合來調節細胞的移動、黏附、分化和聚集等生理功能，在腫瘤部位高表達。證實了透明質酸在膠質瘤上也有一定的靶向功能，它主要是通過受體介導作用，增加病灶區的富集濃度，達到腫瘤靶向的目的。
[0017]通過細胞實驗，考察了所得多糖基大分子前藥在U87細胞(人惡性膠質母細胞瘤細胞)和C6細胞(大鼠神經膠質瘤細胞)中的攝入情況;與阿霉素原藥對比，在相同藥物濃度下測定U87和C6細胞中的熒光強度。
[0018]基于裸鼠原位腦膠質瘤模型，使用cy5.5分子標記大分子前藥并通過尾靜脈注射，借助小動物活體熒光成像儀觀察大分子前藥的體內代謝分布，發現本發明大分子前藥(Lf-HA-D0X)具有良好的穿透BBB到達腫瘤的靶向能力及在腫瘤處的聚積能力。
[0019]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
[0020](I)本發明通過化學作用偶聯了乳鐵蛋白，作為一種低密度脂蛋白的配體，使得抗腫瘤藥物能夠跨躍血腦屏障，從而將藥物遞送至腦內。透明質酸本身具有腫瘤靶向性，透明質酸通過與CD44受體的特異性結合來調節細胞的移動、黏附、分化和聚集等生理功能，對腫瘤生長起到重要作用，以透明質酸作為大分子前藥的主體骨架，可以增加病灶區藥物的富集濃度，達到腫瘤靶向的目的。實現了對膠質瘤的雙重靶向；
[0021](2)腫瘤部分微環境偏酸性，采用酸敏感的酰腙鍵鍵合抗腫瘤阿霉素，可以賦予其腫瘤響應性，使得抗腫瘤藥物在未到達病兆部位時不釋放，降低其毒副作用；
[0022](3)本發明復合物與現有的神經膠質瘤靶向研究相比，雙靶向遞送為其突出特征，既可通過主動靶向作用跨過血腦屏障，又可靶向作用于腦膠質瘤，減少了目的基因在其他細胞中非特異性表達，提高了藥物利用率；
[0023](4)本發明采用靜脈注射給藥途徑符合納米載體的發展方向，避免了腦內局部注射的創傷，方便臨床推廣應用；
[0024](5)本發明的工藝簡單，操作方便，所需設備及原材料廉價。
【附圖說明】
[0025]圖1為Lf-HA-DOX前藥的分子結構；
[0026]圖2為用PBS，D0X，HA_D0X和1^-說-0(?處理后的06膠質瘤裸鼠的1(-1生存曲線；
[0027]圖3為C6膠質瘤裸鼠腦組織(I)和心臟組織(2)HE染色。其中，A(A1，A2):PBS對照組；B (BI，B2): DOX 組;C (CI，C2): HA-DOXM; D (DI，D2): Lf-HA-DOX 組。
【具體實施方式】
[0028]以下結合具體實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。
[0029]以下實施例中所提到的藥物、設備或器材，如無特別說明，均為本領域技術人員常用的藥物、設備或器材。
[0030]實驗例中所用到的