球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法及抗腫瘤應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物的提 取方法及抗腫瘤應用。
【背景技術】
[0002] 球形芽抱桿菌(Bacillus S地ae;ricus，Bs)，革蘭氏染色呈陽性，是一種末端有膨 大的內生抱子囊的好氧細菌，其菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，并且閃著油脂樣的光，菌 落為白色或淡黃色。球形芽抱桿菌的培養體有營養體期和芽抱期兩個發育階段，其中二元 毒素蛋白在其芽抱期產生。球形芽抱桿菌的細胞形態在不同發育階段的形態有所不同。營 養體期細胞形態為桿狀，周圍有鞭毛，并且活動活躍。在芽抱期時，由于芽抱的形成使菌體 的末端膨大，呈鼓植狀突起，待芽抱成熟，伴胞晶體被包在芽胞外膜內。不同的球形芽抱桿 菌的芽抱其形態和大小都不同。在球形芽抱桿菌生長時期，有些菌株會產生伴胞晶體，有些 不產生。伴胞晶體與殺蚊活性相關。所有的球形芽抱桿菌，由于缺乏=簇酸循環的中間酶導 致其不能代謝糖類物質，但是可W利用其它碳化合物作為碳源。球形芽抱桿菌在40°C生長， 生物素、硫胺素等生長因子能促進其生長。
[0003] 在芽抱形成時期兩個蛋白相互作用折疊組成晶體，單獨表達的BinA和BinB不能形 成伴胞晶體，只能形成無定形包含物。只有BinA蛋白對蚊蟲有毒，但是毒力比較小。單獨的 BinB對蚊蟲無毒，但是能夠增強BinA蛋白的毒力。只有它們同時存在，才能對蚊蟲有較高的 毒性。Western-Blot實驗表明BinA和BinB蛋白間沒有交叉反應，說明運兩個蛋白之間沒有 同源性。一般認為，BinA決定毒素蛋白的殺蚊活性和特異性，而BinB主要與蚊幼蟲的腸敏感 位點特異性結合。二者同時存在，才能發揮毒素蛋白的殺蚊毒性。
[0004] 生物毒素是由生物體產生并使其他生物體受到傷害或者致死的物質。生物毒素不 僅具有毒理作用，還具有藥理作用。生物毒素也稱為天然毒素，包括植物、動物、微生物所產 生的有毒物質。根據作用機理，運些毒素分為:細胞溶解霉素、直接作用于細胞、抑制蛋白質 合成、作用于離子通道、作用于細胞骨架、溶血或凝血的毒素等。生物毒素一般均有抗癌活 性，有些生物毒素對腫瘤細胞具有直接殺傷作用，有些生物毒素抑制腫瘤的血管再生，從而 抑制腫瘤生長。
[0005] 微生物代謝產物包括毒素，在治療和/或抑制腫瘤或在腫瘤輔助診斷、預后中有廣 泛應用，包含球形芽抱桿菌2317-2的基因重組或組合物及其抗癌作用等生物活性，及其應 用上的基因重組或組合物、相關代謝產物、生物毒素的抑制/殺滅真菌、細菌、蚊蟲、腫瘤細 胞等生物活性及其應用。然而，目前關于球形芽抱桿菌2317-2的胞外代謝產物的相關抗腫 瘤方面的研究未見報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法及抗 腫瘤應用，經該提取方法分離純化得到了球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物二元毒素晶體 蛋白，經證實該二元毒素晶體蛋白能夠有效應用于抗腫瘤藥物的制備中。
[0007] 本發明是通過W下技術方案來實現：
[0008] 本發明公開了一種球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物在制備抗腫瘤藥物中的應 用，所述球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物為二元毒素晶體蛋白。
[0009] 所述二元毒素晶體蛋白是由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB組成。
[0010] 所述的藥物為抗肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7或乳腺癌皿LA的藥 物。
[0011] 所述的藥物為促進腫瘤細胞調亡、抑制腫瘤細胞增殖或抑制腫瘤細胞遷移的藥 物。
[0012] 本發明還公開了上述的球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法，包括W下 步驟：
[0013] 1)將球形芽抱桿菌2317-2在LB固體培養基上活化后，接種于LB液體培養基中，在 30°C下震蕩培養過夜；
[0014] 2) Wl: 100的比例，將培養過夜的菌液轉接入MBS培養基中，震蕩培養至芽抱晶體 從菌株中完全釋放，收集發酵液，離屯、取沉淀，將沉淀洗涂后重懸處理，然后在超聲波處理， 直至晶體、芽抱及細胞碎片充分分散，震蕩混勻，除去泡沫，離屯、，取沉淀；
[0015] 3)向沉淀中加水制成懸液，再加入溶菌酶，使懸液中溶菌酶的終濃度為0.1~ 0.2mg/ml，然后再37°C處理2~化，期間每30min取出輕柔混勻數次，然后離屯、收集沉淀；
[0016] 4)向沉淀中加入雙蒸水制成懸液，然后加入50mM DTT充分混勻后，于27°C下靜置 化，離屯、收集沉淀；
[0017] 5)將沉淀在-20°C下凍融，加入復方泛影葡胺溶液，混勻后離屯、，收集上清液，在無 菌水中透析后，低溫真空冷凍制得凍干粉，得到球形芽抱桿菌伴胞晶體蛋白，4°C保存。
[001引步驟2)所述洗涂采用0.5mol/L的NaCl;所述超聲波處理是在4°C，20曲z，200W的條 件下處理25min，期間每破碎5s，停頓5s。
[0019 ]步驟4)是按Iml雙蒸水中含有70mg沉淀的量向沉淀中加入雙蒸水。
[0020]步驟5)中，加入質量濃度為42 %~44 %的復方泛影葡胺溶液，透析時間為24~ 4化。
[0021 ] 步驟2)、3)、4)及5)中所述的離屯、均是在8000~lOOOOr/min下，離屯、10~20min。
[0022] 與現有技術相比，本發明具有W下有益的技術效果：
[0023] 本發明公開了球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物一一二元毒素晶體蛋白在制備 抗腫瘤藥物中的應用，通過球形芽抱桿菌2317-2菌株胞外代謝產物對人腫瘤細胞增殖的抑 制實驗、對人腫瘤細胞調亡影響的實驗W及對人腫瘤細胞遷移的影響實驗，證實了該二元 毒素晶體蛋白具有特異性抑制腫瘤細胞生長的作用，因而能夠有效應用于抗腫瘤藥物的制 備中。實驗結果顯示:該球形芽抱桿菌2317-2提取的胞外代謝產物對肝癌細胞7721、肝癌細 胞7402、肺癌細胞A549、乳腺癌細胞MC巧及乳腺癌細胞皿LA等腫瘤細胞均顯示較好的抑制 作用，抑制率分別為:95%、75%、72%、64%、57%。本發明為尋找和發現新型的抗腫瘤藥物 提供依據，拓展尋求發現抗腫瘤藥物的范圍，提出新的研究思路及新的研究領域。
[0024] 本發明還公開了球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物的提取分離方法，通過對該球 形芽抱桿菌2317-2的分批發酵，對其細胞進行裂解離屯、等處理，獲得芽抱桿菌代謝產 物一-二元毒素晶體蛋白。該提取方法操作簡單、對設備及環境要求低，經該方法提取分離 的晶體蛋白純度局。該晶體蛋白是由二兀毒素組成的，由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB蛋白多膚組成，二者的同時存在才能形成伴胞晶體，缺一不可。
【附圖說明】
[0025] 圖1為球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物提取物作用不同時間對SMMC7721細胞的 抑制作用；
[0026] 圖2流式細胞術檢測球形芽抱桿胞外代謝產物對腫瘤細胞調亡的影響結果;其中， (a)為陰性對照組；（b)為0.167mg/mL組；（C)為0.25mg/mL組；（d)為0.375mg/mL組;Ql為壞死 細胞;Q2為晚調細胞;Q3為正常細胞;Q4為早調細胞；
[0027] 圖始田胞劃痕實驗檢測球形芽抱桿菌胞外代謝產物對腫瘤細胞遷移的抑制作用
[0028] 圖4球形芽抱桿菌胞外代謝產物的不同濃度、不同作用時間對SMMC7721細胞遷移 的影響。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0030] 本發明所設及的球形芽抱桿菌2317-2菌株由中國科學院武漢病毒研究所饋贈，該 菌株為已知菌株，如在文獻"Bei 化n,Haizhou Liu,et al.Mole州Iar Qiaracterization of a Glucokinase with Broad Hexose Specificity from Bacillus sphaericus S化ain C3-41[J]APPLI邸 AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGYJune2007，p.3581-3586。" 存在報道。
[0031] I、球形芽抱桿菌2317-2胞外代謝產物一一二元毒素晶體蛋白的提取
[0032] 球形芽抱桿菌胞外代謝產物包括二元毒素晶體蛋白分離純化的方法為：
[0033] 首先在LB固體培養基上活化菌株后，接種于LB液體培養基中，3(TC震蕩培養過夜； 第二天Wl: 100比例轉接入MBS培養基中，震蕩培養使芽抱晶體從菌株中完全釋放;此時收 集發酵液，1000 Og離屯、IOmin;沉淀用0.5mol/L的NaCl離屯、洗涂一次后，重懸，超聲波處理(4 °C，20k化，200W，破碎5sec，停5sec，共處理25min)，待晶體、芽抱和細胞碎片充分分散后，震 蕩混勻，除去泡沫，離屯、，取沉淀;將沉淀加水制成懸液，按終濃度0 . Img/ml加入溶菌酶，37 °C處理化，每30min拿出來輕柔混勻數次，離屯、收集沉淀；按70mg沉淀/ml雙蒸水制成懸液， 加入50mM DTT充分混勻后，靜置于27°C處理化;離屯、收集沉淀;-20°C凍融一次，加入42%復 方泛影葡胺(泛影酸鋼和泛影葡胺Wl :6.6比例配制），混勻后離屯、，使芽抱晶體純度提高。 100(K)rpm離屯、20min，收集上清，并在無菌水中透析4她，檢測可溶性晶體蛋白的濃度;低溫 真空冷凍條件下制成凍干粉，4°C保存。
[0034] 獲得芽抱桿菌代謝產物一一二元毒素晶體蛋白，該晶體蛋白是由二元毒素組成 的，由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB蛋白多膚組成，二者的同時存在才能形成伴胞 晶體，缺一不可。
[0035] 2、腫瘤細胞培養及抑制率檢測
[0036] 1)肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7、乳腺癌皿LA等細胞均購自美國 ATCC細胞庫，于含10%胎牛血清的1640培養液中，置于37°C、5%C0播養箱中培養。
[0037] 2)接種:0.25%膜蛋白酶消化細胞，計數板計數后用相應的培養基(含10%胎牛血 清）制備細胞懸液，并W-定密度接種于96孔板中（乳腺癌細胞系MCF7,2X IO4個/孔、肺癌 細胞系A549，1.5 X IO4個/孔、宮頸癌細胞系化La，1.5 X IO4個/孔、肝癌細胞系肥L7402，3 X 1 〇4個/孔、肝癌細胞系SMMC7721，3 X 1 〇4個/孔、VSMC，2 X 1 〇5個/孔、皿VEC，3 X 1 〇4個/孔），體 積為18化L/孔。每組設5個平行孔。空白對照孔只加18化L/孔的培養基，不加細胞懸液。
[0038] 3)貼壁:培養板放在細胞培養箱中，培養2地，使細胞貼壁。
[0039] 4)給藥:實驗組加入待測藥物20化，陰性對照組加入20化含溶劑的培養基，細胞培 養箱中培養作用4她。
[0040] 5)呈色：小屯、吸