細胞接種組合物和用于治療骨區的方法
【專利說明】細胞接種組合物和用于治療骨區的方法
[0001 ] 相關申請參考
[0002]本申請要求2013年9月2日提交的美國臨時專利申請N0.61/872，828的權益，由此將其按引用全部并入。
[0003]罝量
[0004]本發明公開內容涉及治療患者患病或受損的組織，并且特別涉及用于治療患者骨區的方法和組合物，例如在缺血性壞死中可能發生的缺血和/或壞死的骨區的治療中。
[0005]缺血性壞死(AVN)的特征在于存在死小梁骨區域，常常涉及軟骨下骨板。關節下的骨和身體中的承載面的退化可能引起失去軟骨的支撐，導致嚴重的關節退化。在50%的患者中看到了由骨壞死引起的嚴重關節破壞，并且在美國每年進行的500,000例全髖關節置換的10%主要外科手術計劃治療AVN13AVN最常見的是影響髖關節并且常常在軟骨磨損至需要全部或部分關節置換前的較年輕的患者中發生。關節表面下的支撐骨退化后，常常跟隨著軟骨的損傷，導致關節疼痛、不穩定。常見的治療主要局限于清創術和自體骨移植，其在技術上是有挑戰性的，其中外科醫生從患者收集松質骨，需要第二個切口，并且會出現合并癥。如果骨移植程序不成功或處置不當，需要股骨頭或全關節成形術來替代。
[0006]盡管已經進行了相當大的努力來改善涉及患病或受損骨的這個領域和其他領域的治療，但進展緩慢。對用于修復缺陷骨區(包括由AVN引起的那些)的改進和/或備選的組合物和方法存在需求。
[0007]挺述
[0008]在某些方面中，本發明公開內容涉及用于治療骨組織的組合物和方法。優選的組合物和方法涉及呈現出缺血性壞死的小梁骨組織的治療，例如，用于誘導這樣的組織區域中新的骨生長。
[0009]因此，在本發明的一些實施方案中，本發明公開內容提供了用于治療患者呈現出缺血性壞死的區域骨的方法。該方法包括在該區域植入內皮祖細胞和間質干細胞，優選在組合物中混合，并且所述組合物還理想地包括固體載體材料，如膠原性胞外基質(ECM)組織材料。該組合物有利地包括相對于間質干細胞至少等量，并且優選地，較大量的內皮祖細胞，理想地，以至少1.5:1，至少2:1，或至少3:1的相應比例。在某些形式中，這樣的比例在約2:1至約10:1的范圍中。膠原ECM組織當使用時可以保留來自源組織的天然生物活性物質，包括糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖和生長因子(例如，FGF-2)和/或保留來自源組織的天然肝素。
[0010]在另外的實施方案中，本發明公開內容涉及包括如上概述的成分和/或本公開內容別處鑒定的成分的組合物，以及用于制備所述組合物的方法。
[0011]在閱讀本文的公開內容時，所屬領域技術人員將清楚另外的實施方案及其特征和優點。
[0012]登述
[0013]?將參考某些實施方案，并且將使用特定的語言來描述這些實施方案。然而，將明白沒有因此打算限制本發明的范圍。如同通常被本發明所涉及領域的技術人員想到的，考慮了所述實施方案的任何改變和更多變化以及如本文中所述的本發明原理的任何進一步的應用。
[0014]如以上公開的，本發明的某些方面涉及包括內皮祖細胞(EPC)和間質干細胞(MSC)的組合并且優選還包括胞外基質組織的組合物，其制備方法，及其用于治療患病或受損骨區(例如，壞死的骨)的用途。
[0015]如以上公開的，本文的組合物和方法將涉及內皮祖細胞(EPC)的使用。EPC是未成熟的內皮細胞，其具有增殖、轉移和分化成內皮細胞的能力，但尚未獲得成熟內皮細胞的特征。EPC包括但不限于集落形成單位-內皮細胞(CFU-EC)、循環血管生成細胞(CAC)、循環內皮前體(CEP)和內皮集落形成細胞(ECFC)，包括低增殖力ECFC(LPP-ECFC)和/或高增殖力ECFC(HPP-ECFC)。在優選的方面中，EPC是或包括ECFC，如HPP-ECFC。
[0016]EPC可以從血液、骨髓或臍帶血分離并且可以在成人外周單核細胞中的⑶34+細胞級分中鑒別出來。EPC可以響應某些生理刺激，如，例如，組織損傷，從骨髓轉移至外周血(循環EPC)。循環EPC可以獲自成人血液。在某些方面中，可以使用CD34+細胞或單獨的CD133+細胞或與KDR+結合作為外周血中富含EPC的細胞級分，通過直接FACS分選或其他可用的體外選擇方法，如磁珠、微流體、芯片實驗室(lab-on-a-chip)、親和性柱或相關設備，從這些或其他來源分離EPC。
[0017]如以上公開的，ECFC是用于本文中的優選細胞。理想地，ECFC獲自臍帶血。ECFC的特征在于:表達細胞表面蛋白KDR、⑶34、vffF、eNOS和VE-鈣粘蛋白，缺乏造血細胞標記⑶45、AC133、CD1 Ib和⑶14的表達；以克隆涂布水平增殖并替換成二代和三代ECFC的能力；結合乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL)的能力；在體外形成毛細管樣結構的能力；和/或在免疫缺陷小鼠體內形成人血管并結合鼠脈管系統變成鼠系統循環一部分的能力。用于本文中的ECFC細胞群可以是基本上純化的ECFC(在結合MSC之前)，例如，克隆ECFC群或其中至少90%，或至少95%，或100%的細胞呈現如上所述的ECFC特征的細胞群。對于關于ECFC及其制備方法的其他信息，例如可以參考美國專利公開N0.20050266556(2005年12月I日)，20080025956(2008年I月31 日)和20090280180(2009年 11 月12 日)。
[0018]用于本發明的MSC可以獲自任何合適的來源并且以任何合適的方式獲得。合適的MSC來源包括例如胎盤組織，骨髓，牙齒組織，睪丸組織，子宮組織，臍帶血，臍帶組織和皮膚組織。可以在與其他細胞的混合群中，例如，在未分級的骨髓吸出物或純化的骨髓單核細胞中提供MSC。還可以在相對純的MSC群中提供MSC，例如，其中群中至少90 %的細胞表達CD105，CD106，CD156，CD44，CD29，CD166，Stro-1、FGF10、Prxl、0ct4、Sox2 和 Nanog 并且沒有表達⑶34、CD45、⑶14和⑶31。優選獲自臍帶血的MSC。對于關于MSC及其獲得方法的其他信息，例如可以參考美國專利申請20120052049(2012年3月I日)。
[0019]EPC和MSC可以各自獨立地是患者自體同源或同種異體的。說明性地，在某些實施方案中，EPC和MSC都是患者同種異體的，例如，使用源自臍帶血的同種異體EPC和同種異體MSC。在其他實施方案中，EPC是患者自體同源的(例如，獲自患者的臍帶血或外周血)，并且MSC可以是患者同種異體的(例如，獲自同種異體的臍帶血)。在再進一步的實施方案中，EPC是患者同種異體的(例如，獲自同種異體的臍帶血)，并且MSC可以是患者自體同源的(例如，獲自患者的臍帶血、外周血或骨髓，如含有MSC的骨髓吸出物、含有MSC的純化骨髓單核細胞或更純化的獲自骨髓的MSC制備物的形式)。
[0020]用于本文中的膠原性胞外基質(ECM)材料可以是脫細胞的包括ECM組織的動物組織層。在這點上，本文中使用的“脫細胞的”是指其中ECM組織天然的全部或基本上全部的細胞已經被除去的ECM組織的狀態；因此，其他(非天然)細胞可以存在于ECM組織上或其中，仍然將其稱為脫細胞的。ECM組織層可以獲自溫血脊椎動物，如綿羊、牛或豬動物的源組織。源組織層優選是未礦化的(即，軟組織)源組織。例如，合適的ECM組織包括包含粘膜下層、腎小囊膜、真皮膠原、硬腦脊膜、心包膜、羊膜、闊筋膜、漿膜、腹膜或基底膜層的那些，包括肝基底膜。用于這些目的的合適粘膜下層材料包括，例如，腸粘膜下層，包括小腸粘膜下層，胃粘膜下層，膀胱粘膜下層和子宮粘膜下層。可以通過采集這樣的組織來源并且從平滑肌層、粘膜層和/或組織源中出現的其他層中分出含有粘膜下層的基質來獲得本發明中有用的包含粘膜下層(可能連同其他相關組織一起)的ECM組織。豬組織源是優選的來源，從其采集ECM組織，包括含有粘膜下層的ECM組織。
[0021]本發明中使用的ECM組織優選的是脫細胞的并且是高度純化的，例如，如Cook等的美國專利N0.6 ,206 ,931或2008年11月20日公開的美國專利申請公開N0.US2008286268，2008年7月23日提交的公開美國專利申請系列N0.12/178,321中所述的，由此將其全部以其整體按引用并入本文中。優選的ECM組織材料將呈現出低于約12內毒素單位(EU)/克，更優選低于約5EU/克，并且最優選低于約IEU/克的內毒素水平。作為另外的優選，粘膜下層或其他ECM材料可以具有低于約I集落形成單位(CFU)/克的微生物量(b1burden)，更優選低于約0.5CFU/克。真菌水平理想地是相似地低，例如，低于約ICFU/克，更優選低于約0.5CFU/克。核酸水平優選地低于約Syg/mg，更優選地低于約2yg/mg，并且病毒水平優選地低于約50空斑形成單位(PFU)/克，更優選地低于約5PFU/克。美國專利N0.6,206,931或美國專利申請公開N0.US2008286268中教導的粘膜下層或其他ECM組織的這些和另外的特征可以是本發明中使用的任何ECM組織的特征。
[0022]在某些實施方案中，本文中使用的ECM組織材料將是膜狀組織，具有從組織源分離的層結構。ECM組織當完全水合時可以如分離的具有從約50至約250微米范圍的層厚度，更常見地為當完全水合時從約50至約200微米，盡管也可以獲得和使用具有其他厚度的分離層。這些層厚度可以隨著用作組織源的動物的類型和年齡而不同。同樣，這些層厚度可以隨著從動物源獲得的組織源而不同。
[0023]利用的ECM組織材料理想地保留來自源組織的結構微