使用雄激素靶向療法用于治療腫瘤性疾病的生物標記物的制作方法
【專利說明】使用雄激素靶向療法用于治療腫瘤性疾病的生物標記物
[0001 ] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年8月12日遞交的美國臨時專利申請61/865，038，2014年5月8日 遞交的美國臨時專利申請61 /990，5 70和2014年5月2 2日遞交的美國臨時專利申請6 2/00 2， 110的優先權，其全部內容在此通過引用并入本申請。
[0003] 發明背景
[0004] 癌癥是人類健康的主要負擔，估計占每年全部死亡人數的13%。特別是，幾種常見 的癌癥和疾病都與雄激素激素信號相關聯，例如，前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺 癌和多囊卵巢病。例如，前列腺癌(PCa)是男性的第二大常見癌癥。大多數前列腺癌導致的 死亡是由于轉移性疾病的發展，其對常規雄激素剝奪療法沒有響應。自1940年以來，雄激素 剝奪療法一直是患有前列腺癌的對象的標準治療方法。盡管阻斷了雄激素，大多數對象最 終仍出現病情惡化。多年來該疾病的晚期階段被稱為"激素不敏感性前列腺癌"或"雄激素 非依賴性前列腺癌"。已經很清楚，雄激素剝奪治療后出現的前列腺癌仍依賴于雄激素。存 活的前列腺癌細胞獲得了導入低水平的循環雄激素(從腎上腺表達)的能力，變得對這些低 水平的睪酮敏感得多，并且在前列腺癌細胞本身內部實際上合成了睪酮。前列腺癌的這個 階段，現在被稱為"去勢抵抗性前列腺癌"或CRPC。
[0005] 識別對前列腺癌的治療可能會有響應或正在響應的那些患者是對這種疾病進行 醫療管理的目標。雖然目前的臨床指導原則都集中在癥狀、前列腺特異性抗原(PSA)的血液 水平和成像研究上，但其它生物標記物也可能對臨床決策有用。仍需要針對該疾病的生物 標記物和它們與識別治療性化合物的功效或毒性之間的關系，和可以提供關于最可能對治 療劑有響應的患者的識別信息的生物標記物，或用以識別正在接收治療劑卻沒有響應的患 者(無論是通過原生性或獲得性耐藥機制），或預測那些可能會產生不良副作用的患者。
[0006] 發明簡述
[0007] 下面所列的各生物標記物可以用于，例如，在治療患者的過程中各個點評估治療 方案。例如，可以使用生物標記物在不同的癌癥治療轉變點通過對一個或多個生物標記物 或生物標記物群組的分析以識別和優化治療選擇，從而評估治療方案。生物標記物也可以 用于預測在同一患者體內對現有抗癌治療無反應或缺乏反應以及對蓋樂特龍 (galeterone)的響應。在一個實施方案中，在前列腺癌的治療中進行生物標記物檢測并將 其與蓋樂特龍(galeterone)的功效相關聯。
[0008] 提供了一種治療需治療患者體內疾病的方法，包括:a)確定該疾病是否以雄激素 受體的改變形式為特征;和b)如果所述雄激素受體的改變形式存在時，給予所述對象包含 治療有效量的式I化合物的藥物組合物，
[0010]或其藥學上可接受/的鹽、N-氧化物、活性代謝物、前藥、或溶劑化物;其中R^H或 乙酰基;R2是苯并咪唑。
[0011 ]例如，辦是乙酰基，所述化合物是蓋樂特龍的前藥。
[0012] 例如，辦是!1并且R2是苯并咪唑，該化合物為蓋樂特龍。
[0013] 本發明提供了在需治療的患者中治療癌癥的方法，其包括:a)從所述患者獲得樣 品，例如循環腫瘤細胞的樣品；b)確定雄激素受體的截短形式是否是存在于樣品中，例如 ARV-7或AR-V567es;和c)如果所述雄激素受體的改變形式存在時，給予所述對象包含治療 有效量的式I化合物的藥物組合物，
[0015] 或其藥學上可接受的鹽、N-氧化物、活性代謝物、前藥、或溶劑化物;其中心是!1或 乙酰基;R2是苯并咪唑。例如，辦是11，1? 2是苯并咪唑，化合物是蓋樂特龍。在一些實施方案中， 雄激素受體的改變形式是缺乏配體結合域的截短的AR，例如ARV-7。所述確定可以包括，例 如，使用能結合雄激素受體的配體結合域的抗體，從而所述抗體結合的缺失導致信號缺失。 所述確定還可以包括使用兩種抗體，例如一個用于AR的NH 2端并且另一個用于AR的C00H端 (配體結合域），以區分或獲得存在NH2端與不存在C00H端(配體結合)的比率。在一個優選的 實施方案中，分析結果是相同的對象樣品中的NH 2端和C-端的抗體檢測信號的比率。所述確 定還可以包括通過定量或定性的核酸擴增或通過基因表達分析來檢測缺乏配體結合域的 截短的AR。在一個實施方案中，對缺乏配體結合域的截短AR的檢測是來自患者或對象的樣 品，例如其中已經對所述患者/對象樣品進行了循環腫瘤細胞富集。在另一個實施方案中， 對患者/對象樣品進行了循環DNA富集。在又一個優選實施方案中，所述患者/對象樣品是腫 瘤活檢或組織樣品。
[0016] 在一些實施方案中，所述疾病是前列腺疾病，例如前列腺癌。前列腺癌可以是去勢 抗性的。在某些情況下，對象已經經歷過去勢治療，例如化學去勢或外科去勢，或已經歷雄 激素受體拮抗劑治療或減少新生雄激素產生的治療，例如干擾類固醇通路，例如CYP-17裂 解酶抑制劑，或聯合治療。在一些實施方案中，所述疾病是癌癥，諸如卵巢癌、膀胱癌、胰腺 癌或乳腺癌。所述癌癥可以是對抗雄激素劑(如雄激素受體拮抗劑)有抗性的，例如對恩雜 魯胺（enzalutamide)或比卡魯胺（13；^311^3111丨(16)或41^-509有抗性。所述癌癥可以是對 CYP17裂解酶抑制劑有抗性的，例如，對阿比特龍(abiraterone)有抗性。所述癌癥可以是對 紫杉烷有抗性，例如多西紫杉醇或卡巴他賽。在一些實施方案中，所述疾病對雄激素依賴。
[0017 ]患者可以確定為具有突變的雄激素受體，例如截短的AR如AR-V1、AR-V2、AR-V3、 AR-V4、AR-V5、AR-V567es、AR-V6、或AR-V7。突變的AR可以攜帶點突變，例如T877A(T878A)、 D879G(D878G)、W741C、W741L、M749L、R629Q、G142V、P533S、T575A、H874YSF876L。
[0018]本發明還提供一種優化對需治療患者體內疾病的治療的方法，包括:識別正使用 治療方案對疾病進行治療的患者，其中所述治療方案包括給予式I的化合物：
[0020]或其藥學上可接受的鹽、N-氧化物、活性代謝物、前藥、或溶劑化物;其中心是!1或 乙酰基;R2是苯并咪唑；確定至少一個生物標記物的狀態；以及基于對所述生物標記物的確 定，維持或修改治療方案。在一個優選的實施方案中，心是11并且R 2是苯并咪唑。
[0021 ]例如，所述生物標記物是雄激素受體的表達水平或功能，例如野生型或突變的AR。 突變的AR可以是剪接變體和/或截短的AR，包括AR-V1、AR-V2、AR-V3、AR-V4、AR-V5、AR-V567es、AR-V6、或AR-V7。突變的AR可以是具有點突變的AR，包括但不限于，T877A(T878A)、 D879G(D878G)、W741C、W741L、M749L、R629Q、G142V、P533S、T575A、H874Y、F876L。
[0022] 在一些實施方案中，所述疾病是前列腺疾病，例如前列腺癌。前列腺癌可以是去勢 抗性的。在一些實施方案中，所述疾病是癌癥，諸如卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌或乳腺癌。所述 癌癥可以是對抗雄激素劑（如雄激素受體拮抗劑）有抗性的，例如對恩雜魯胺 (enzalutamide)或比卡魯胺或ARN-509有抗性。所述癌癥可以是對紫杉燒類有抗性的，例如 多西紫杉醇或卡巴他賽。在某些情況下，對象已經經歷過去勢治療或已經經歷過雄激素受 體拮抗劑治療，或兩者同時治療。在一些實施方案中，所述疾病是雄激素依賴性疾病。
[0023] 生物標記物也可以是循環腫瘤細胞數量的減少，例如其中所述循環腫瘤細胞數量 是在蓋樂特龍(galeterone)治療至少一周之后確定的。合適的生物標記物包括，但不限于： 細胞凋亡的CTC增加;PSA的減少或PSA倍增時間的降低;PSMA表達的增加；腫瘤 18F-DHT-PET 信號的降低;基于組織活檢的測試，例如ProMark;蛋白體降解通路成員的存在或表達;5-激 肽釋放酶組;治療前的和治療后的睪酮血濃度;在治療方案開始后的至少一個類固醇的水 平的變化;代謝標記物，例如P450酶的水平;CYP17蛋白的突變或變體;CTLA-4阻斷的確定； 前列腺健康指數;PCA3的存在或水平;前列腺核有絲分裂測試;在細胞循環進展基因中的突 變的存在；由血清學試驗來確定的血紅蛋白、乳酸脫氫酶、或堿性磷酸酶的水平;和對化學 療法的抗性(包括恩雜魯胺或阿比特龍、比卡魯胺或ARN-509)。
[0024] 通過引用并入
[0025]所有在本說明書中提及的出版物、專利和專利申請在此通過引用并入本發明中， 就如同每個獨立的出版物、專利或專利申請被詳細的并且單獨的通過引用并入一樣。
[0026]附圖的簡單說明
[0027]本發明的新穎特征具體闡述在所附的權利要求中。通過參考下面的闡明說明性實 施例(應用了本發明的原理)的詳細描述以及所附的附圖，可以更好地理解本發明的特征和 優點：
[0028]圖1描繪了雄激素受體(AR)及其可變剪接變體。
[0029] 圖2表明了蓋樂特龍(galeterone)下調全長和剪接變體AR，并減少CWR22rvl細胞 系的細胞增殖。
[0030]圖3表明了蓋樂特龍(galeterone)克服由于AR剪接變體產生的對阿比特龍和恩雜 魯胺(enzalutamide)的抗性。蓋樂特龍，而不是恩雜魯胺(enzalutamide)，降低了全長和剪 接變體AR-V7蛋白。
[0031] 圖4表明了蓋樂特龍(galeterone)在CWR22rvl細胞系中同時降低了全長和AR-V7 蛋白。
[0032] 圖5表明了蓋樂特龍(galeterone)在用AR-V7剪接變體轉染的DU145細胞中降低了 AR-V7〇
[0033] 圖6表明了在72小時的曝露時間內，蓋樂特龍(galeterone)減小全長和剪接變體 AR-V7〇
[0034] 圖7描繪了對去勢有抗性和對恩雜魯胺(enzalutamide)有抗性的細胞系的增殖。 [0035]圖8描繪了對去勢有抗性和對恩雜魯胺(enzalutamide)有抗性的細胞系對蓋樂特 龍(galeterone)的響應。
[0036] 圖9A描繪了LNCaP和對恩雜魯胺(enzalutamide)有抗性的LNCaP細胞的雄激素受 體(AR)和前列腺特異性抗原(PSA)的蛋白質免疫印跡。
[0037] 圖9B描繪了蓋樂特龍（galeterone)在對恩雜魯胺（enzalutamide)有響應和對恩 雜魯胺(enzalutamide)有抗性的LNCaP細胞中對AR和PSA蛋白水平的作用。
[0038]圖10描繪了在存在或不存在恩雜魯胺(enzalutamide)的情況下，用合成雄激素處 理的細胞內雄激素受體的定位。
[0039] 圖11描繪了在恩雜魯胺（enzalutamide)或蓋樂特龍（galeterone)存在或不存在 的情況下，用合成雄激素處理的CPRC細胞系內雄激素受體的定位。
[0040] 圖12描繪了在恩雜魯胺（enzalutamide)或蓋樂特龍(galeterone)存在或不存在 的情況下，用合成雄激素處理的對恩雜魯胺(enzalutamide)有抗性的細胞系中雄激素受體 的定位。
[0041 ] 圖13描繪了在恩雜魯胺（enzalutamide)或蓋樂特龍(galeterone)存在或不存在 的情況下，用合成雄激素處理的對恩雜魯胺(enzalutamide)有抗性的細胞系中雄激素受體 的定位。
[0042] 圖14描繪了用恩雜魯胺（enzalutamide)或蓋樂特龍（galeterone)處理的細胞系 中AR熒光素酶報告基因的活動。
[0043]圖15A表明了免疫熒光實驗的設計，以使得所使用的測試化合物的核定位可視化。 [0044]圖15B描述了圖15A中描述的實驗的結果，并顯示了蓋樂特龍(galeterone)，而不 是恩雜魯胺(enzalutamide )，降低AR核易位。
[0045] 圖16表明了對去勢有抗性的表達AR-V7的腫瘤對蓋樂特龍(galeterone)的響應。 采用RT-PCR在LuCaP136去勢抗性的異種移植腫瘤中檢測到了 AR-V7。
[0046]圖17表明了蓋樂特龍(galeterone)下調攜帶AR-T878A突變的雄激素受體。
[0047]圖18表明了蓋樂特龍(galeterone)對野生型AR和AR點突變的結合測定結果。
[0048]圖19表明了蓋樂特龍(galeterone)降低在具有野生型AR的細胞中和具有AR點突 變的細胞中的AR-依賴性基因表達。這些細胞也表達具有F876L突變的AR受體。
[0049] 圖20表明了由PSA引起的在CRPC和恩雜魯胺(enzalutamide)抗性細胞系中的PSA 減少。
[0050]圖21描繪的方案示出對AR變體的檢測，其中C-末端域已丟失。
[00511圖22表明了一個研究的結果，其中用蓋樂特龍(galeterone)治療的具有丟失C-末 端AR的患者(4/4)顯示最大的PSA響應(>50%)。
[0052] 發明詳述
[0053] 定義
[0054] 本發明所用的"對象"指的是臨床試驗的患者或對象和更廣泛地含有表達的遺傳 材料的生物實體。也包括組織(包括活組織檢查材料）、細胞和來自對象體內或體外培養獲 得的它們的后代。
[0055] "樣品"是指從對象中移除的流體、固體或組織，并且包括全血、血清、血漿、組織、 精液、細胞、組織活檢、粘液、糞便、骨、牙齒、鼻或喉或臉頰拭子、尿、皮膚、眼淚、器官活檢 (肝、腎、結腸、肺、胰腺）、腫瘤活檢、或腫瘤組織、循環腫瘤細胞、來自原發腫瘤或轉移組織 的外來體(exosomes)。樣品還可以包括所收集的來自對象的流體、固體或組織的一部分，例 如循環腫瘤細胞或分析物。"經處理的樣品"是指來自對象的流體、固體或組織通過實驗室 技術進行處理、處置、或管理以富集分析物。"經處理的全血樣品"是指該全血樣品通過體外 實驗室技術進行處理來分析全血樣品的組成部分包括細胞、DNA、RNA、蛋白質、肽、或如下所 述的分析物;例如，在全血樣品中發現的細胞可被富集、洗滌、并單獨分析;更具體地，循環 腫瘤細胞可以從全血樣品中富集并用于生物標記分析，并且這些生物標記物可以包括雄激 素受體的突變形式。另一例子是富集全血樣品中的DNA(例如循環DNA或腫瘤細胞DNA)，其可 用于生物標記物分析，并且這些生物標記物可以包括雄激素受體的突變形式。
[0056] 所謂"分析物"是指待分析的樣品的物質或組成。示例性的分析物包括一種或多種 以下的一種或多種物質：蛋白質、肽、多肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、mRNA、RNA、微小RNA、長 的非編碼RNA、DNA、循環DNA、cDNA、抗體、碳水化合物、多糖、葡萄糖、脂質、氣體(例如，氧氣 或二氧化碳）、電解質（例如，鈉、鉀、氯化物、碳酸氫鹽、BUN、鎂、磷酸鹽、鈣、氨、乳酸、鋅、檸 檬酸鹽）、脂蛋白、膽固醇、脂肪酸、糖蛋白、蛋白聚糖、脂多糖、細胞表面標記物(例如，CD3、 0)4、0)8、11^1?、或0)35)、腫瘤標記物(8(^-2、1(卜6741?1(5)、前列腺特異性抗原(？34)、胞質 標記物、治療劑、治療劑的代謝物、細胞(例如，全細胞、腫瘤細胞、循環腫瘤細胞、干細胞、白 血細胞、T細胞(例如，顯示003、004、008、幾21?丄035、或其他表面標記物）、或用一個或多個 具體的標記物識別的另一細胞）。如本發明所用，術語"小分子"是指一種藥、藥物、藥品、或 其它被考慮用于人類治療用途的化學合成的化合物。如本發明所用，術語"生物的"是指來 源于生物源而非合成的物質，且其被預期用于人類治療用途。生物標記物可以用作生物體 的特定疾病狀態或特定的生理狀態的指標的生物物質，通常生物標記物是體液中測量的蛋 白質或其它天然化合物，其濃度反映疾病狀態或機能障礙的存在與否或嚴重程度或所處階 段，可用于監測治療疾病或病癥或功能障礙的治療進展，或可作為臨床結果或進展的替代 測量。如本發明所用，術語"代謝生物標記"是指一種物質、分子、或合成的或生物衍生的化 合物，其用于確定患者或對象的肝或腎功能的狀態。如本發明所用，"基因分型"指的是確定 在特定基因中可能會影響或不影響該特定基因表型的遺傳差異的能力。如本發明所用，術 語"表型"是指由基因型設定的作為(代謝或生理的）結果的蛋白質的生物表達。如本發明所 用，術語"基因表達圖譜"是指以時間或空間的方式，確定生產的基因產物的速率或量，或在 特定組織中基因轉錄的活性的能力。如本發明所用，術語"蛋白質組分析"是指蛋白質圖樣 或陣列，以確定在正常和病變組織中的蛋白質或肽的關鍵差異。另外的示例性分析物也在 本發明中有所描述。術語分析物還包括樣品的組分，所述組分是初始靶分析物用生化方法 擴增的直接產物，如核酸擴增反應的產物。
[0057]聯合治療:如本發明所用的術語"聯合治療"，是指的那些情形:兩個或更多不同的 藥物試劑以重疊方案施用使得對象同時暴露于兩種或多種試劑，或使用時間方案施用從而 使得對象依次暴露于兩個或多個試劑。
[0058]給藥方案：在本發明中使用的術語"給藥方案"，是指一組單位劑量(通常超過一 個），其通過時間周期分隔開單獨施用。特定藥劑的推薦劑量的集合（即，量、時間、給藥途徑 等)構成其給藥方案。
[0059] 起始:如本發明所用術語"起始"，當其應用于給藥方案時，可以被用來指第一次施 用藥劑給先前沒有接受過所述藥物試劑的對象。或者或另外，術語"起始"可被用來指在對 象的治療期間，施用特定單位劑量的藥物試劑。
[0060] 藥物試劑:如本發明中所使用的，短語"藥物試劑"是指當施用于對象，具有治療作 用和/或得到所需的生物和/或藥理學作用的任何試劑。
[0061] 藥學上可接受的酯：如本發明所用，術語"藥學上可接受的酯"是指在體內水解的 酯，并且包括那些在人體內易分解，以留下母體化合物或其鹽的酯。
[0062] 治療有效量:術語藥物試劑或試劑組合的"治療有效量"是指試劑以任何醫學治療 的合理益處/風險比，賦予經受治療的對象治療效果的量。治療效果可以是客觀的（即，可通 過一些測試或標記物測量的）或主觀的（即對象給出的表示或感覺到效果）。治療有效量通 常以給藥方案施用，其可以包括多個單位劑量。對于任何特定的藥物試劑，治療有效量(和/ 或有效給藥方案中的適當單位劑量)可以變化，例如，根據給藥途徑，與其它藥劑組合。同 時，具體的治療有效量(和/或單位劑量)對于任何特定對象可能取決于多種因素，包括所治 療的病癥和病癥的嚴重程度;所使用的具體藥劑的活性;所使用的具體組合物;對象的年 齡、體重、一般健康狀況、性別和飲