一種雙向梯度血管內皮生長因子的神經導管制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于神經再生組織工程以及血管組織工程技術領域，尤其涉及一種雙向梯度血管內皮生長因子的神經導管制備方法。
【背景技術】
[0002]神經損傷后，雪旺細胞激活，迀移形成Bungner帶，引導再生軸突向受損遠端延伸，通過受損部位。在神經挫傷，由于神經內膜結構完整，雪旺細胞以其為支架進行迀移。但是，最新的研究發現，在神經橫斷后，神經內膜連接結構破壞，雪旺細胞迀移是通過再生的血管為支架。并且血管的方向生長對于引導雪旺細胞方向性迀移和軸突方向性生長至關重要。
[0003]在神經損傷長節段神經缺損時，必須通過導管橋接，實現其結構連接。因此，如何實現神經導管快速方向性血管化，并引導雪旺細胞分別由受損遠端和近端快速方向性迀移入神經導管內，成為加速軸突快速通過橋接部位，促進功能恢復的關鍵。
[0004]VEGF具有趨化內皮細胞迀移并促進血管生成作用。大量研究發現，通過基因工程高表達VEGF具有神經保護作用，并促進神經再生。但是這些研究沒有解決如何加速神經導管血管化，促進神經快速通過橋接部位的問題。馬福凱等研究發現通過與普通膠原導管相比，VEGF功能化的導管能夠顯著的促進神經再生。有研究發現，度梯度的引導，不能實現快速的向神經導管中央方向性的血管化，限制內皮細胞能夠向高濃度極化，并加速向高VEGF濃度方向性迀移成血管。因此，不具有濃度梯度神經導管促進神經導管，由于沒有方向性濃弓I導雪旺細胞迀移入導管內速度，進而限制VEGF通過神經導管的速度。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種雙向梯度血管內皮生長因子的神經導管制備方法，旨在通過制備具有雙向梯度的VEGF的導管，可以加速神經導管方向性血管化，引導雪旺細胞由受損兩端快速方向性迀移如神經導管內，從而促進神經再生，解決無濃度梯度VEGF導管促進血管化不具有方向性問題。
[0006]本發明是這樣實現的，一種雙向梯度血管內皮生長因子的神經導管制備方法，該雙向梯度血管內皮生長因子的神經導管制備方法包括以下步驟:
[0007]步驟一，靜電紡絲PCL導管的制備:將PCL溶于10%的甲醇/氯仿的混合溶液制備靜電紡絲溶液，通過微量注射栗控制電紡溶液的流速為2ml /h-4ml /h，靜電紡絲裝置兩極間電壓設定為20kV，注射器和接收器之間的距離為15cm，應用21-G針形噴嘴，接收器為直徑1.5mm的鋼棒，制備內徑為1.5mm，長度為1.5cm的PCL導管，在真空干燥箱中干燥，除去殘余溶劑，得到PCL導管；
[0008]步驟二，PCL導管雙向梯度氨解:將PCL導管用細鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2mlEP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加入蒸餾水，當浸沒導管后停止加水，繼續反應5min-10min;之后用PBS洗去未反應的乙二胺;得到中央部-NH2密度高，向兩端-NH2密度逐漸減低的梯度導管；
[0009]步驟三，肝素偶聯反應制備雙向梯度的肝素化導管:將步驟二所得具有雙向梯度-NH2的PCL導管放入嗎啉乙磺酸緩沖體30min，移除嗎啉乙磺酸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺/肝素溶液，避光脫色搖床過夜，將肝素共價結合到攜帶氨基的導管上，PBS洗去未結合的肝素，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的肝素化導管；
[0010]步驟四，雙向梯度VEGF導管制備:雙向梯度的肝素化導管，放入2mlEP管中，加入2ml 100ng/ml的VEGF溶液，4 °C浸泡過夜，吸出VEGF溶液，加入PBS溶液潤洗，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的VEGF功能化的導管。
[0011 ] 進一步，所述步驟一中將PCL溶于10 %的甲醇/氯仿的混合溶液中甲醇/氯仿按體積質量比占混合溶液的10%，按體積比甲醇:氯仿=1:5。
[0012]進一步，所述步驟二中，將1.5cmPCL導管用細鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2mlEP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加入蒸餾水，當浸沒導管后停止加水，繼續反應5min-10min。
[0013]本發明另一目的在于提供一種PCL導管雙向氨解裝置，該PCL導管雙向氨解裝置包括2ml EP管、細鐵絲、PCL導管和微量注射栗。所述PCL導管設置在內部盛有乙二胺溶液2mlEP管內部，所述細鐵絲穿過PCL導管，所述內部裝有蒸餾水的微量注射栗與2ml EP管連接。
[0014]進一步，所述PCL導管通過彎曲對折垂直設置在2ml EP管內部。
[0015]本發明另一目的在于提供一種雙向梯度的VEGF功能化的神經導管促進神經再生方法，該雙向梯度的VEGF功能化的神經導管促進神經再生方法包括:
[0016]雙向梯度的VEGF功能化的神經導管中央部釋放高濃度的VEGF，通過趨化作用，加速受損神經兩端的內皮細胞向雙向梯度的VEGF功能化的神經導管中央高濃度處迀移;加速神經導管由兩端向中央方向性血管化，生成的血管作為支架，引導雪旺細胞快速方向性迀移進入神經導管，從而加速神經再生并沿雪旺細胞向遠端延伸。
[0017]進一步，所述雙向梯度的VEGF功能化的神經導管，其中央所負載的VEGF量高，而兩端所負載的VEGF量相對較少
[0018]本發明提供的雙向梯度的VEGF功能化的神經導管，其中央所負載的VEGF量高，而兩端所負載的VEGF量相對較少，能夠通過趨化作用受損神經兩端的內皮細胞向導管中央高濃度處迀移，加速神經導管由兩端向中央方向性血管化。同時生成的血管能夠作為支架引導雪旺細胞快速迀移進入神經導管，從而促進神經的再生并沿雪旺細胞向遠端延伸。但是本發明中VEGF在整個神經導管中結合均一，不具有濃度梯度。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發明實施例提供的雙向梯度血管內皮生長因子的神經導管制備方法流程圖；
[0020]圖2是本發明實施例提供的PCL導管雙向氨解裝置示意圖；
[0021]圖中:l、2mlEP管;2、細鐵絲;3、PCL導管;4、微量注射栗。
[0022]圖3是本發明實施例提供的神經修復4周后導管中央雪旺細胞迀移及神經再生情況圖；
[0023]圖中:A-C、單純PCL神經導管組;D-F、PCL神經導管復合VEGF，沒有梯度;G-1、PCL神經導管復合VEGF，具有雙向梯度。
[0024]圖4是本發明實施例提供的感覺神經及運動神經再生情況圖。
[0025]圖中:(A_C，G)、檢測的背根神經節中感覺神經元情況；(D_F，H)、檢測的脊髓中運動神經再生情況。
【具體實施方式】
[0026]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0027]下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
[0028]如圖1，所示，本發明實施例的雙向梯度血管內皮生長因子的神經導管制備方法包括以下步驟:
[0029 ] S11:靜電紡絲PCL導管的制備:將PCL溶于1 %的甲醇/氯仿的混合溶液制備靜電紡絲溶液，通過微量注射栗控制電紡溶液的流速為2ml/h-4ml/h，靜電紡絲裝置兩極間電壓設定為20kV，注射器和接收器之間的距離為15cm，應用21-G針形噴嘴，接收器為直徑1.5mm的鋼棒，制備內徑為1.5mm，長度為1.5cm的PCL導管，在真空干燥箱中干燥，除去殘余溶劑，得到PCL導管；
[0030]5102:?(^導管雙向梯度氨解:將1.5(^ PCL導管用細鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2ml EP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應5min-20min，然后微量注射栗以lml/h-3ml/h速度向EP管中加入蒸餾水，當浸沒導管后停止加水，繼續反應5min-10min;之后用PBS洗去未反應的乙二胺;得到中央部-NH2密度高，向兩端-NH2密度逐漸減低的梯度導管；
[0031]S103:肝素偶聯反應制備雙向梯度的肝素化導管:將S102所得具有雙向梯度-NH2的PCL導管放入嗎啉乙磺酸緩沖體30min，移除嗎啉乙磺酸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺/肝素溶液，避光脫色搖床過夜，將肝素共價結合到攜帶氨基的導管上，PBS洗去未結合的肝素，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的肝素化導管；
[0032]S104:雙向梯度VEGF導管制備:雙向梯度的肝素化導管，放入2mlEP管中，加入2mll00ng/ml的VEGF溶液，4 °C浸泡過夜，吸出VEGF溶液，加入I3BS溶液潤洗，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的VEGF功能化的導管。
[0033]所述SlOl中將PCL溶于10%的甲醇/氯仿的混合溶液中甲醇/氯仿按體積質量比占混合溶液的10%，按體積比甲醇:氯仿=1:5。
[0034]所述S102中，將PCL導管用細鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2ml EP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加