成纖維細胞生長因子-21在治療腎纖維化中的應用
【專利說明】成纖維細胞生長因子-21在治療腎纖維化中的應用
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及成纖維細胞生長因子-21的一種新用途，即成纖維細胞生長因子-21在治療腎纖維化中的應用。
【背景技術】
[0003]腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同轉歸及主要的病理基礎，是嚴重危害人類健康的重要疾病之一。腎間質纖維化是以細胞外基質(ECM)，如膠原1、
I1、II1、IV型、纖維連接蛋白、層連蛋白，在腎間質過多的積聚及腎間質成纖維細胞增生為主要特征。阻止和逆轉腎間質纖維化的進展是治療CKD、控制腎功能衰竭的關鍵。腎間質纖維化的發病機制十分復雜，包括炎癥反應、氧化應激反應、腎小管上皮細胞轉分化等。
[0004]近年來學術界對氧化應激在腎間質纖維化中的作用展開了深入的研究。氧化應激反應是腎間質纖維化發生發展的關鍵環節，在腎間質纖維化發生發展的全過程中都起著重要作用。纖維化始動階段:各種能導致腎間質纖維化的始動因素如炎癥、剪應力、低氧、細胞因子都會影響腎臟固有細胞(腎小管上皮細胞，腎小球系膜細胞等)及炎癥浸潤細胞(巨噬細胞等)的氧化還原狀態，刺激上述細胞產生大量ROS AOS與細胞膜上的碟脂、核酸等大分子物質形成脂質過氧化產物(LPO)，直接損傷腎臟固有細胞導致腎臟細胞凋亡、肥大或轉分化，促進腎間質纖維化發生;纖維化發展階段:上游刺激因素導致各種致纖維化信號產生后，需要ROS作為重要的第二信使，傳遞和放大各種致纖維化信號。研究表明:ROS可介導趨化因子(如MCP-1、ICMA-1等)大量釋放，并促進炎性細胞在腎臟聚集；ROS也可誘導血管緊張素 Π (Ang1tenin Π , Ang Π )、轉化生長因子-β? (Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等致纖維化關鍵細胞因子的產生并進一步介導其下游的致纖維化效應。
[0005]目前臨床上缺少有效治療腎間質纖維化的藥物，治療的措施主要在于控制原發疾病及惡化因素，如降血糖、降血壓、控制感染、調血脂、攝入優質蛋白飲食及改善腎臟局部的微循環等。但這些方式都只能很有限地緩解疾病的發展，當腎臟損傷發展到腎纖維化不可逆轉階段時，患者只能通過血液、腹膜透析或腎移植來進行腎臟替代治療維持生命。臨床上大多數CKD患者出現了臨床癥狀后再來尋求藥物治療，此時腎臟已存在不同程度的纖維化病變。因此探討藥物對已形成的纖維化病變的治療作用更具有臨床意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供成纖維細胞生長因子-21在治療腎纖維化中的應用。
[0007]本發明還保護一種治療和/或預防腎纖維化的藥物，其活性成分為成纖維細胞生長因子-21。所述藥物還包括其它藥學上可接受的載體或輔料。所述藥物中，除了所述活性成分外，可以添加藥學上允許的賦形劑、填充劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、增效劑和添加劑等。所述藥物的給藥形態可為針劑(如粉劑、水劑、油劑)。所述制劑都可采用本領域技術人員熟知常用的制備方法而獲得。所述藥物的給藥途徑可為皮下注射、靜脈注射或肌肉注射。
[0008]以上任一所述成纖維細胞生長因子-21為如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療和/或預防腎纖維化的功能的由序列I衍生的蛋白質。
[0009]所述成纖維細胞生長因子-21對腎纖維化的治療作用體現為(Cl)至(c7)中的至少一種:
(Cl)抑制腎纖維化程度；
(c2)抑制腎纖維化發生；
(c3)降低腎臟中膠原纖維和/或肌纖維的水平；
(c4)降低腎臟中24小時尿白蛋白，血清肌酸酐及血清尿素氮的水平；
(c5)降低腎臟中I型膠原蛋白和/或α-平滑肌肌動蛋白的水平；
(c6 )降低腎臟中Co IIV和/或FN的水平；
(c7)降低腎臟中TGF-β和/或磷酸化Smad2/3的水平；
以上任一所述成纖維細胞生長因子-21具體可采用包括如下步驟的方法制備:
(1)表達所述成纖維細胞生長因子-21與分子伴侶的融合蛋白；
(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細胞生長因子-21。
[0010]所述分子伴侶具體可為分子泛素樣修飾蛋白(即分子伴侶SUM0)。
[0011]所述“表達所述成纖維細胞生長因子-21與分子伴侶的融合蛋白”的實現方法如下:將所述成纖維細胞生長因子-21的編碼基因插入原核表達載體pSUMO，得到重組質粒;將所述重組質粒導入大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌;發酵所述重組菌并采用IPTG進行誘導，得到所述融合蛋白。
[0012]所述“切除所述分子伴侶”的實現方式如下:取所述融合蛋白，用SUMO蛋白酶I(SUM0蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比具體可為1: 50)和DTT(所述DTT的初始濃度可為2mmol/L)切割(切割條件具體可為4°C切割過夜)。
[0013]所述成纖維細胞生長因子-21的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的DNA分子:
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；
3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。
[0014]所述嚴格條件為在0.1 X SSPE(或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0015]本發明發現成纖維細胞生長因子-21能夠有效抑制腎纖維化的發生，可作為藥物治療和/或預防腎纖維化，對于腎纖維化的治療和預防具有重大價值。
【附圖說明】
[0016]圖1為FGF-21溶液的聚丙烯凝膠電泳圖。
[0017]圖2為HE染色和Masson染色結果。
[0018]圖3為Masson染色的表面密度。
[0019]圖4為24小時尿蛋白，血清肌酸酐及血清尿素氮結果。
[0020]圖5為ColI基因，a-SMA基因，I型膠原蛋白基因和α-平滑肌肌動蛋白基因蛋白的表達水平，I型膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白相對β-actin的蛋白水平。
[0021 ] 圖6為，Co IIV基因和FN基因的表達水平和含量。
[0022]圖7為TGF-β基因的表達水平，TGF-β蛋白相對β-actin蛋白的蛋白水平和磷酸化Smad2/3蛋白相對Smad2/3蛋白的蛋白水平。
[0023]圖8為HIPK2相對β-act in的蛋白水平。
【具體實施方式】
[0024]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0025]FGF-21蛋白的，簡稱FGF-21，如序列表的序列I所示。FGF-21的編碼基因如序列表的序列2所示。
[0026]原核表達載體pSUMO(在文獻中被稱為“pHisSUMO”):參考文獻:姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUMO融合系統高效表達可溶性重組蛋白的研究.東北農業大學學報，2008，39(10): 57-62;李璐，尹成凱，李德山.高效表達可溶性重組蛋白表達載體——pHisSUM0.生物技術，2009，19(3): 11-14.。
[0027]大腸桿菌Rosetta(DE3):北京全式金生物技術有限公司，目錄號CD801。
[0028]雄性db/db小鼠:上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物質量合格證號SCXK(滬)2015-0005。
[0029]PBS緩沖液(pH 7.2):溶劑為水，溶質及其濃度如下:NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP04 10 mmol/Τ,,ΚΗ^ΡΟ^