一種包含cxcr3 抗體的碳納米管光聲造影劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物領域，特別涉及一種包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]光聲成像是近年來發展起來的一種新型生物醫學成像方法。當脈沖激光照射到生物組織中時，組織的光吸收域將產生光聲信號，生物組織的光聲信號攜帶了組織的光吸收特征信息，通過測量光聲信號能重建出組織中的光吸收分布圖象。光聲成像結合了純光學成像高對比度特性和純超聲成像高穿透深度特性的優點，從原理上避開了光散射的影響，突破了高分辨率光學成像深度“軟極限”(?Imm)，可實現50mm的深層活體內分子成像。由于腫瘤組織和正常組織對光吸收的差異(在近紅外激光的照射下，癌變組織和周圍正常組織的光吸收差異至少5倍以上)和不同生理狀態的生物組織對光的吸收不同，利用光聲成像就可以反映了組織的結構特征，同時還可能反映組織的代謝狀態、病變特征、甚至神經活動。因此，光聲成像必將帶來生物醫學影像領域的一次革新。
[0003]碳納米管(CNTs)獨特的分子結構決定了它具有優異的力學、熱學、光學以及電磁性能，近年來，碳納米管在生物醫學方向的潛在應用逐漸成為新的熱點。CNTs在近紅外光區能產生強烈的熒光，可以在復雜的生物體環境中被檢測，但是要求碳管本身結構完整，同時需要呈單分散，這就在一定程度上限制了其應用，而且純的碳納米管在生物體有一定的毒性。
[0004]CXCR3蛋白在正常組織/細胞，原位膽囊癌組織/細胞及膽囊癌轉移組織/細胞中的表達水平依次遞增，且與臨床預后密切相關，CXCR3在高轉移潛能的膽囊癌細胞及膽囊癌轉移灶中高表達，其在在多種腫瘤細胞中也表現出表達異常，并且其可能在腫瘤細胞的發生、演進、異質化、增殖、細胞周期、侵襲轉移及耐藥性等惡性生物學行為方面扮演重要角色
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是為了克服現有的碳納米管材料分散度不高，對生物體具有一定毒性的缺點，提供了一種包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑及其制備方法。
[0006]因此，本發明是通過下述技術方案來解決上述技術問題:
[0007]本發明采取的技術方案之一為:一種包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0008](I)將氯金酸溶液與多胺基陽離子聚合物溶液混合避光攪拌0.5-1.5小時，之后于85°C _95°C保持0.5-1.5小時，制得納米金溶液；
[0009](2)伴隨超聲、攪拌，將羧基化多壁碳納米管溶液逐滴加入步驟(I)所得的納米金溶液中，滴加完成后超聲20-30分鐘，攪拌30-60分鐘使之充分混合，之后在55°C _65°C保持20-36小時，制得納米金-支化聚乙稀亞胺-碳納米管溶液，在所得納米金-支化聚乙稀亞胺-碳納米管溶液中逐滴加入巰基化聚乙二醇溶液，超聲攪拌45-50小時，制得巰基化聚乙二醇-納米金-支化聚乙烯亞胺-碳納米管溶液；
[0010](3)在步驟⑵所得的巰基化聚乙二醇-納米金-支化聚乙烯亞胺-碳納米管溶液中加入氯金酸溶液攪拌0.5-1.小時，攪拌完畢后逐滴加入硼氫化鈉溶液，充分反應之后加入2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，攪拌20-30分鐘，N-羥基琥珀酸亞胺溶液，攪拌15-20分鐘，充分混合后加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽溶液，反應20-30分鐘，加入CXCR3抗體溶液，2-3小時后離心，將所得下層溶液干燥即得。
[0011]步驟(I)為:將氯金酸溶液與多胺基陽離子聚合物溶液混合避光攪拌0.5-1.5小時，之后于85°C _95°C保持0.5-1.5小時，制得納米金溶液。本發明所述多胺基陽離子聚合物為本領域常規的多胺基陽離子聚合物，較佳地為支化聚乙烯亞胺(Branched-PEI)、支化聚丙烯酰胺(PAM)、四乙烯五胺(TEPA)或三乙烯四胺(TETA)，更佳地為支化聚乙烯亞胺，其分子量為Mnl0000-Mnl800。所述多胺基陽離子聚合物的制備方法為本領域常規制備方，或市售可得。其中步驟(I)所述攪拌的速度為常規，較佳地為150rpm。攪拌的溫度為850C _95°C，較佳地為90°C。攪拌的時間為0.5-1.5小時，較佳地為I小時。其中所述氯金酸溶液的濃度較佳地為0.1-0.4mg/mL，更佳地為0.2mg/mL，所述多胺基陽離子聚合物溶液的濃度較佳地為5-20mg/mL，更佳地為10mg/mL。其中所述加熱的方式為本領域常規加熱方式，較佳地為油浴加熱。其中所述多胺基化合物和氯金酸的質量比較佳地為50:1-300:1，更佳地為200:1，其中所得納米金溶液中的納米金顆粒平均直徑為5-30nm，更佳地為10nm。
[0012]步驟⑵為:伴隨超聲、攪拌，將羧基化碳納米管溶液逐滴加入步驟⑴所得的納米金溶液中，滴加完成后超聲20-30min，攪拌30-60min使之充分混合，之后在55°C _65°C保持20-36小時，制得納米金-支化聚乙稀亞胺-碳納米管溶液，在所得納米金-支化聚乙稀亞胺-碳納米管溶液中逐滴加入巰基化聚乙二醇溶液，超聲攪拌45-50小時，制得巰基化聚乙二醇-納米金-支化聚乙烯亞胺-碳納米管溶液。其中所述碳納米管較佳地為羧基化多壁碳納米管，該羧基化多壁碳納米管的長度較佳地為0.5-2 μ m，直徑較佳地為20-30nm，羧基含量較佳地為0.5-3%，更佳地為1.23%，所述百分比為質量百分比。所述羧基化多壁碳納米管溶液的濃度較佳地為0.3-1.2mg/mL，更佳地為0.6mg/mL，所述巰基化聚乙二醇溶液的濃度較佳地為0.5-2mg/mL，更佳地為lmg/mL。其中所述巰基化聚乙二醇為本領域常規的巰基化聚乙二醇，所述巰基化聚乙二醇的分子量較佳地為0.5-20kDa。其中所述超聲的方法為本領域常規的超聲分散方法，所述超聲分散中的超聲強度為常規的超聲強度度，較佳地為 200w。
[0013]步驟(3)為:步驟(2)所得的巰基化聚乙二醇-納米金-支化聚乙烯亞胺-碳納米管溶液中加入氯金酸溶液攪拌0.5-1.小時，攪拌完畢后逐滴加入硼氫化鈉溶液，充分反應之后加入2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，攪拌20-30分鐘，N-羥基琥珀酸亞胺溶液，攪拌15-20分鐘，充分混合后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽溶液，反應20-30分鐘，加入CXCR3抗體溶液，2-3小時后離心，將所得下層溶液干燥即得。其中所述硼氫化鈉的純度較佳地為95-98%，更佳地為97%，所述百分比為質量百分比。其中所述加入氯金酸與步驟(I)加入的氯金酸質量比較佳地為1:3-2:3，更佳地為2:3。其中所述攪拌的時間為本領域常規的攪拌時間，更佳地為I小時，所述攪拌的速度為常規攪拌速度，更佳地為150rpm。其中所述離心為本領域常規的離心方法，所述離心的速度較佳地為8000rpm-12000rpm，更佳地為lOOOOrpm。其中所述2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液(MES緩沖液)為本領域常規的MES緩沖液，其濃度較佳地為l_2mg/mL，更佳地為lmg/mL。所述N-輕基琥珀酸亞胺溶液(NHS溶液)為本領域常規的NHS溶液，其濃度較佳地為0.5-2mg/mL，更佳地為lmg/mL。所述1-乙基-(3- 二甲基氨基丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽溶液(EDC溶液)為本領域常規的EDC溶液，其濃度較佳地為0.5-2mg/mL，更佳地為lmg/mL。所述CXCR3抗體溶液的濃度較佳地為2.5-10mg/mL，更佳地為5mg/mL。
[0014]其中巰基化聚乙二醇-納米金-支化聚乙烯亞胺-碳納米管與NHS的質量比較佳地為200:1-300:1，更佳地為250:1 ;巰基化聚乙二醇-納米金-支化聚乙稀亞胺-碳納米管與H)C的質量比較佳地為0.8:1-1.2:1，更佳地為1: 1，巰基化聚乙二醇-納米金-支化聚乙烯亞胺-碳納米管與CXCR3抗體的質量比較佳地為0.8:1-1.2: 1，更佳地為1:1。其中所述干燥為本領域常規的干燥方法，較佳地為真空冷凍干燥。
[0015]本發明采取的技術方案之二為:一種包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑，所述碳納米管光聲造影劑是由碳納米管、多胺基陽離子聚合物、納米金顆粒、巰基化聚乙二醇和CXCR3抗體通過共價結合而成。
[0016]其中所述多胺基陽離子聚合物較佳地為支化聚乙烯亞胺、支化聚丙烯酰胺、四乙烯五胺或三乙烯四胺，更佳地為支化聚乙烯亞胺。其中所述納米金顆粒的平均直徑較佳地為5-30nm，更佳地為25nm，其中所述碳納米管較佳地是羧基化多壁碳納米管，所述羧基化多壁碳納米管的長度較佳地為0.5-2 μ m，直徑較佳地為20-30nm，羧基含量較佳地為1.23%,所述百分比為質量百分比。其中所述CXCR3為本領域常規的CXCR3抗體，該抗體的制備方法為本領域常規制備方法或市售可得。
[0017]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0018]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0019]本發明的積極進步效果在于:本發明公開的包含CXCR3抗體的光聲造影劑的制備方法是以碳納米管、聚乙烯亞胺等多胺基陽離子聚合物、納米金、巰基化聚乙二醇、硼氫化鈉和CXCR3抗體作為原料，采用兩步法合成納米復合材料，該制備方法不僅操作簡便，而且具有綠色環保等優點。本發明所述包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑在水中的分散性好，穩定性強，具有良好的生物相容性。本發明所述包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑用于光聲成像技術中，不僅能產生較強的光聲信號，而且還具有高度的腫瘤細胞靶向性。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發明所述碳納米管光聲造影劑結構示意圖。
[0021]圖2為本發明所述碳納米管光聲造影劑的透射電鏡圖。
[0022]圖3為本發明所述包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑的光聲響應圖。
[0023]圖4為本發明所述包含CXCR3抗體的碳納米管光聲造影劑在PBS緩沖液(pH =7.4)中穩定性檢測結果。
【具體實施方式】
[0024]下面通過實施例并結合附圖的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。其中所述室溫為常規，若無特別說明為15?35°C