甲基阿魏酸在制備預防和治療酒精性肝病藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥技術領域，具體地說是甲基阿魏酸在制備預防和治療酒精性肝病 藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 酒精性肝病(alcoholic liver disease ALD)是由于長期大量飲酒所導致的肝臟 疾病，初期通常表現為脂肪肝，如果損傷持續存在，進而可發展成酒精性肝炎、肝纖維化和 肝硬化，嚴重酗酒時可誘發廣泛肝細胞壞死甚至肝功能衰竭。酒精濫用和酒精依賴己成為 當今世界上日益嚴重的公共衛生問題，在我國酒精性肝病是僅次于病毒性肝炎的第二大肝 臟疾病。隨著我國居民生活方式、膳食結構的改善和酒類產量及變種的增加，我國酒精性肝 病在所有肝病中的比例有逐年增加趨勢。因此研究有明確療效的治療酒精性肝損傷的藥物 顯得非常必要。積極開展有效中草藥及其單體藥物防治酒精性肝病的臨床研究，成為肝病 領域面臨的新課題。
[0003] 酒的主要成份乙醇，經胃腸消化器官后約有90%在肝臟中被代謝。乙醇代謝過程 會產生大量的活性氧(reactive oxygen species，R0S) AOS包括超氧陰離子(〇2_)、過氧化 氫(H202)、羥自由基(0H-)，過量的R0S使得機體抗氧化因子耗竭，打破體內氧化還原狀態的 平衡，表現在肝臟超氧化物歧化酶（S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶 (CAT)等酶的活力下降，丙二醛(MDA)含量增加，肝臟損傷，導致脂質代謝異常，肝臟炎癥反 應，肝臟纖維化，是ALD發病的重要機制。
[0004] 甲基阿魏酸是從蟬翼藤莖皮提取得到的有機酸類化合物，化學名為3，4_二甲氧 基-苯丙烯酸，分子結構式如下：
[0005]
[0006] 現有報道表明，甲基阿魏酸具有較強的抗病毒、免疫增強和抗纖維化等多種活性。 甲基阿魏酸抗肝纖維化的作用體現在可以抑制肝星狀細胞HSC-T6的增殖與膠原分泌;可以 影響四氯化碳(CCL 4)及D-氨基半乳糖造成的急性肝損傷小鼠模型血清谷丙轉氨酶(ALT)、 谷草轉氨酶(AST)的活性及肝組織MDA、SOD和GSH-Px的含量;可以影響CCL 4造成的慢性肝纖 維化大鼠模型的血清AST、ALT、膽紅素(BIL)、血清中層粘蛋白（LN)、透明質酸(ΗΑ)、ΙΠ 型前 膠原(PC-m)、IV膠原(IV-C)和肝組織中羥脯氨酸(HyP)含量，來實現抗纖維化的作用。
[0007] 甲基阿魏酸對乙醇誘導的酒精性肝病的預防與治療作用卻未見報道。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供甲基阿魏酸的新用途，即在制藥中的應用。
[0009] 本發明的技術方案是:一種甲基阿魏酸的新用途，它是用于治療酒精性肝病，即是 將從蟬翼藤中提取出的甲基阿魏酸制成片劑、膠囊、顆粒或注射劑等劑型以治療酒精性肝 病，其劑量為l-l〇〇mg/kg甲基阿魏酸/日，可分成2-3次服用。
[0010]本發明所述甲基阿魏酸是從蟬翼藤莖皮提取得到的有機酸類化合物，其提取工藝 為:將蟬翼藤莖皮粉碎，95%乙醇回流提取3次-浸膏用100~200目硅膠拌樣-以氯仿回流 洗脫-洗脫液減壓濃縮-中壓硅膠色譜三氯甲烷:乙醚（1:5)梯度洗脫-收集洗脫液，揮去 溶劑得白色粉末結晶-再經重結晶和Sephadex LH220凝膠柱色譜純化（甲醇洗脫)-得到 白色針狀結晶。
[0011] 本發明通過乙醇誘導L-02細胞損傷模型證實甲基阿魏酸可以降低MDA水平，并提 高S0D、GSH-Px與CAT的活性。通過動物試驗證明，甲基阿魏酸可以顯著降低急性酒精性肝損 傷大鼠的ALT、AST、MDA含量，顯著提高S0D、GSH-Px和CAT活性；甲基阿魏酸可以明顯降低慢 性酒精性肝損傷大鼠的甘油三酯（TG)、ALT、AST和MDA含量，顯著提高S0D、GSH-Px和CAT活 性。以上細胞與動物實驗結果表明：甲基阿魏酸具有確切的預防和治療酒精性肝病作用，可 單方或復方用于制備預防和治療酒精性肝病的藥物。
【具體實施方式】
[0012] 以下通過實施例對本發明作進一步的闡述：
[0013] 實施例1甲基阿魏酸對乙醇誘導人正常肝細胞系(L-02)的影響
[0014] 1.1不同濃度甲基阿魏酸對L-02細胞存活率的觀察。
[0015] 取對數期細胞接種于96孔板，每孔5000個細胞，24h后加入一定濃度的甲基阿魏 酸，每個藥物濃度設5個復孔，加藥44h后加入MTT( 5mg/ml) 20ul繼續孵育4h，將培養基倒盡， 吸干，每孔加入二甲亞砜200ul，混勻后置自動酶標儀(檢測波長490nm)讀取各孔光密度值 (0D值），記錄結果，并計算存活率。存活率（％) = (實驗組一空白對照組)/(正常對照組一空 白對照）X 100 %。結果見表1。
[0016] 表1.甲基阿魏酸對L-02細胞存活率的影響
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[0018] 從結果可知，500 . Oμg/ml以下的甲基阿魏酸細胞存活率大于90 %，對L-02細胞沒 有毒性。
[0019] 1.2甲基阿魏酸對5%乙醇誘導L-02細胞模型的影響
[0020] L-02細胞接種于96孔板，每孔2萬個細胞，24小時后棄去培養液，將細胞分為10組， 每孔加含10%胎牛血清的DMEM培養基0.2ml和誘導藥物。1為正常組、2為5%乙醇模型組、3-10依次為5 %乙醇模型組+MFA藥物干預，MFA的濃度依次為0.78125、1.5625、3.125、6.25、 12.5、25、50、lOOyg/萬個細胞，每個藥物濃度設5個復孔，細胞培養8h后加 MTT (5mg/ml) 20ul 繼續孵育4h，測0D值并計算存活率。結果見表2。
[0021] 表2甲基阿魏酸對5%乙醇誘導的L-02細胞存活率的影響
[0022]
[0023] bcl-2 備注：**P<0 · 01，ΛΛΡ<0 · 01，ΛΡ<0 · 05。
[0024] 結果通過SPSS的單因數方差分析，模型組與正常組有顯著性差異，Ρ〈0.01，除3、4 藥物干預組外，其余藥物干預組與模型組均有差異(ρ〈0.01或？〈〇.〇5)。7、8、9、10組藥物干 預組對細胞存活率影響接近，組間差異不顯著？>〇.〇5,5、6、7組間差異顯著0〈〇.〇1或？〈 0.05)，因此選擇3.125、6.25和12.5yg/萬個細胞濃度的甲基阿魏酸作為干預細胞的3個藥 物濃度。
[0025] 1.3甲基阿魏酸對5%乙醇誘導L-02細胞內MDA含量和S0D、GSH-Px、CAT酶活性的測 定
[0026]取對數期細胞接種于6孔板，每孔32萬個細胞，在5 %⑶2，37 °C培養箱培養24h，棄 去培養液，將細胞分為正常對照組，5%乙醇模型組和5%乙醇+藥物低、中、高劑量組。每組 加含10%胎牛血清的DMEA培養基0.32ml，模型組入加乙醇使終濃度為5%，藥物組加終濃度 為5%乙醇和甲基阿魏酸(濃度依次為3.125、6.25和12.5yg/萬個細胞），各設3個復孔。培養 箱孵育12h后收集細胞，反復凍融破碎后，按MDA、S0D、GSH-Px和CAT檢測試劑盒方法測定含 量與酶活性，結果見表3。
[0027] 表3.甲基阿魏酸對乙醇誘導L-02細胞MDA、S0D、GSH-Px和CAT的影響
[0028]
[0029] 注：與正常對照組比較叩<0.05，bP<0.01;與模型組比較叩<0.05，dP<0.01。
[0030] 由表3可知，與正常對照組相比，乙醇模型組MDA水平顯著上升，S0D和GSH-Px、CAT 的活性明顯下降(P<〇.01)，經甲基阿魏酸處理，MDA含量下降，S0D、GSH-Px和C