使用親和性樹脂合成adc的方法
【專利說明】使用親和性樹脂合成ADC的方法
[0001] 本發明涉及合成生物分子-藥物-綴合物的固相方法。尤其，本發明涉及合成抗體-藥物-綴合物(ADC)的固相方法。本發明也涉及產生固定的、化學改性的生物分子例如抗體 的中間方法。
[0002] 除了上述方法，本發明涉及本發明方法的捕獲樹脂、生物分子-藥物-綴合物、中間 體產物和組合物的各種用途。
[0003] 發明背景
[0004] 免疫毒素和抗體藥物綴合物(ADC)是使靶-特異性結合結構域與可被歸類為細胞 毒素的足夠強有力的毒性的藥物分子結合的蛋白質藥物。抗體是用于該目的的產生下述靶 向系統的理想生物分子，所述靶向系統結合了高特異性與高抗原親和性，允許將細胞毒素 藥物運輸至期望的施用位點。這些藥物構建體是針對發現在腫瘤學中尤其流行的疾病的潛 在治療劑。
[0005] 抗體藥物綴合物(ADC)的主要標準是毒素'彈頭'（藥物)在極低水平(picoM)下具 有活性。此外，無論周期中的點，而針對腫瘤細胞具有效力是有利的。就該目的而言，已經發 現DNA活性試劑利于作為毒素候選物，因為DNA損傷，除非可修復的，將驅動細胞凋亡，而無 論周期中的點。
[0006] 原則上，ADC的適當毒素可以是定義為L01ATC分子的任何部分（'解剖學治療學化 學分類系統(Anatomical Therapeutic Chemical Classification System) '，其中L01 是 定義抗腫瘤和免疫調節試劑的亞組，其由WHO藥物統計方法合作中心定義。可選地，可歸類 為用于ADC的適當有效負載的其他部分可簡單地定義為當內化時對細胞有毒性的任何部 分。落在后者目錄中的大多數部分缺少足夠的有效效力。因此，工業趨勢是鑒定和開發'超 效力'材料。
[0007] 對于免疫毒素和ADC研究的基本原理、設計和效力的專家綜述可見：J. Adair等， Expert 0pin.Biol.Ther.，2012，12(9):P1191-206，G.Casi等，Journal of Controlled Release，2012，161，2，P422-428和F?Dosio等，Toxins，2011，3，P848-883 〇
[0008] 許多溶液相方法可用于制造生物分子-藥物-綴合物，例如抗體-藥物-綴合物 (ADC)。但是，溶液相方法它們本身就產生大量的廢物而言是浪費的，并且就合成期間生物 分子-藥物-綴合物的聚集而言是有問題的。
[0009] 用于制造生物分子-藥物-綴合物的溶液相方法中的第一步驟大體上涉及生物分 子的化學改性或活化。例如，在生物分子是抗體的情況下，可通過使抗體還原或部分還原， 將抗體'化學改性'或'活化'。部分還原抗體的適當方法見"Bioconjugate Techniques"， 96/97頁，Greg T .Hermanson，Academic Press;第2版，2008，ISBN-13:978-0123705013。還 原方法中一般采用還原劑，比如TCEP。
[0010] 在抗體的化學改性或活化，例如還原之后，下一步驟是去除任何過多的活化/化學 改性試劑，例如過多的還原劑。該步驟非常耗費時間，因為其有時必須使樣品在分開的分離 柱中運行多次。如果生物分子的穩定性有問題，從降解方面而言這也可能是有問題的。如果 方法涉及用大量過量的還原劑充分還原ThiomAb，化學改性/活化的生物分子的純化的問題 是尤其有問題的。
[0011] 在上面的純化步驟之后，然后化學改性的/活化的例如還原的抗體與藥物部分綴 合。該步驟的主要問題是生物分子-藥物-綴合物高可能性的聚集。當在該過程中采用非常 疏水的藥物時，這尤其有問題。聚集是主要問題，因為其可導致不穩定的生物分子-藥物-綴 合物。在最佳情形下，被生物分子-藥物-綴合物聚集物污染的生物分子-藥物-綴合物必須 被進一步純化，以去除聚集物，其即耗費時間又非常浪費。在純化期間將失去大部分的藥 物，因為其形成聚集的生物分子-藥物-綴合物的一部分。在最差的情形下，整批生物分子-藥物-綴合物被生物分子-藥物-綴合物聚集物污染至整體是不穩定的并且必須被處理的這 樣高的程度。
[0012] 幾乎三十年，腫瘤學家已經致力于利用靶-特異性單克隆抗體將細胞毒素藥物遞 送至腫瘤位點，只要單克隆抗體存在。直到現在，三類毒素占據了該領域。即，刺孢霉素 (0已1；[。116&111；[。；[118)、美登素(1]1&5^&118；[116 8)和阿里他汀（&111'18丨&1：；[118)。這些細胞毒素藥物 類型本質上都通常是疏水的。當綴合至抗體時，它們的存在明顯增加了抗體的總體疏水性， 并且在一些情況下，某種程度上，在綴合物之間的疏水相互作用導致綴合物聚集。基于用于 麥羅塔(Mylotarg)和CMC-544二者的方法都包含色譜法聚集體去除步驟的認識，該問題的 顯著性順序是刺孢霉素〉美登素〉阿里他汀。約50%的美登素方法包含聚集體去除步驟和非 常少的阿里他汀方法包含聚集體去除步驟。
[0013] 最近，基于多米卡新（duocarmycins) (www. syntarga. com)和吡略并苯二氮雜 (pyrollebenzodiazepene) (PBD)二聚體(www. spirogen ? com)的毒素已經綴合至抗體并且 進行臨床前評估。這些新類型的毒素甚至比它們的前驅物細胞毒素藥物類型更疏水并且當 綴合至抗體時，更容易聚集。
[0014] 重大的努力已經聚焦在通過并入親水性連接體調節藥物的疏水性（Zhao等， J. Med. Chem.，2011，54，10，3606-3623)。在聚集體形成不能被控制的情況下，開發人員已經 依靠熟知的技術，用于從蛋白質型治療劑中去除聚集體。這些包括一系列不同的色譜分離， 包括離子交換、疏水相互作用、羥基磷灰石和本領域技術人員熟知的其他分離。采用這樣的 色譜純化技術具有實現足夠產物質量的結果，但是以工藝產率為代價。當與抗體和抗體型 治療劑在制造的背景下一起使用時，通過不明確的伴隨副反應或不想要的物理化學相互作 用，材料的物理損失具有非常嚴重的經濟影響。
[0015] 因此，制造生物分子-藥物-綴合物的常規的溶液相方法具有許多困難，并且期望 提供用于制造生物分子-藥物-綴合物的改進方法。
[0016 ]本發明解決了常規的溶液相方法的一個或多個上述問題。
【發明內容】
[0017] 合成生物分子-藥物-綴合物的方法:
[0018] 根據本發明，提供了合成生物分子-藥物-綴合物的方法，該方法包括：
[0019] (i)使生物分子在適于固定生物分子的情況下接觸捕獲樹脂并且因而提供固定的 生物分子;其中生物分子是抗體、改性的抗體或抗體片段;和其中捕獲樹脂包括選自下述的 生物分子捕獲部分：（1)非肽型的，包括氨基酸型的，蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L模擬物， (2)肽型的蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L模擬物，（3)核苷酸結合位點捕獲部分和(4)糖蛋白 捕獲部分；
[0020] (ii)任選地使固定的生物分子接觸化學改性試劑或活化試劑，以提供化學改性的 或活化的固定的生物分子；
[0021] (iii)使固定的生物分子或化學改性的或活化的固定生物分子接觸藥物組分，以 形成固定的生物分子-藥物-綴合物；
[0022] (iv)從捕獲樹脂釋放生物分子-藥物-綴合物。
[0023] 本發明上述方法的關鍵特征是在該方法中采用的捕獲樹脂能夠以連續和可再生 方式固定生物分子。生物分子連續固定至捕獲樹脂應使得通過上述方法產生的所得生物分 子-藥物-綴合物減少變化。例如，可減少在藥物組分連接至固定的生物分子的點的變化，因 此產生藥物組分和固定的生物分子之間更一致的連接點。這樣的區域特異性的改善從改善 所得生物分子-藥物-綴合物產物的一致性而言應是期望的。
[0024] 與采用母蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L作為生物分子捕獲部分相對，采用非肽型的 蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L模擬物或肽型的蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L模擬物（即上述方 法第一步驟中的（1)或（2))作為生物分子捕獲部分，可使得相對改善生物分子的固定的一 致性，原因是相對于常規的蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L型系統增加了模擬物的區域特異 性。在其中生物分子固定至蛋白質的區域特異性低的情況下，采用母蛋白質A、蛋白質G或蛋 白質L作為生物分子捕獲部分將固有地使得生物分子可變地固定至捕獲樹脂。例如，母蛋白 質A、蛋白質G或蛋白質L可經可使總體相互作用復雜的蛋白質上的其他位點展示非特異性 結合。如上面闡釋，如在本發明中設想的，生物分子與捕獲樹脂的連續性固定可接著使得減 少通過上述方法產生的所得生物分子-藥物-綴合物的變化。這將是有利的。本發明的樹脂 系統的另一優勢在于下述事實：相比常規的蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L型系統的情況，更 寬范圍的藥物可原則上綴合至樹脂。例如，在疏水性分子的情況下，可出現在母蛋白質A、蛋 白質G或蛋白質L型系統中的其他非特異性結合可擾亂或防止這樣的藥物的有效綴合。
[0025] 類似的益處存在于采用核苷酸結合位點捕獲部分或糖蛋白捕獲部分（即上述方法 的第一步驟中的(3)或(4))作為生物分子捕獲部分。
[0026]在一種實施方式中，捕獲樹脂是非蛋白質捕獲樹脂。在一種實施方式中，捕獲樹脂 的生物分子捕獲部分的分子量為約l〇〇〇Da或更小，任選地約500Da或更小、約300Da或更小 或約200Da或更小。在一種實施方式中，捕獲樹脂是非蛋白質捕獲樹脂和捕獲樹脂的生物分 子捕獲部分的分子量為約l〇〇〇Da或更小。
[0027] 與采用母蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L作為生物分子捕獲部分相對，采用非肽型的 蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L模擬物或肽型的蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L作為生物分子捕 獲部分的另一益處是模擬物生物分子捕獲部分與寬范圍的常用抗體綴合化學物質相容并 且可擴大至工業水平。這與蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L型生物分子捕獲部分相反。
[0028] 例如，通常期望將賴酰胺側鏈官能團靶向在固定的抗體上。在目前臨床開發的28 種抗體藥物綴合物中，幾乎一半（下表中灰色陰影的那些)采用賴氨酸引導的綴合化學。蛋 白質A、G或L的表面上固定配體的蛋白質本性使得無意中將賴酰胺側鏈官能團革巴向在蛋白 質捕獲樹脂上。蛋白質A(swiss-prot P02976)具有59個賴氨酸殘基，蛋白質G(swiss-prot P919909)具有59個賴氨酸殘基和蛋白質L(swiss-prot Q51918)具有132個賴氨酸殘基。
[0032]除了如上所述的配體和抗體賴酰胺殘基之間的競爭，蛋白質A、G和L型捕獲樹脂也 存在其他問題。這些包括蛋白質的瀝濾和瀝濾的加合物的免疫原性。這意味著這些親和性 載體不能用于制造過程的目的（用于純化或綴合）。由采用蛋白質A，G和L型捕獲樹脂的這樣 的過程提供的任何綴合物材料不符合目前抗體純化和產物質量的規范指南。
[0033] 合成化學改性的活化、固定的生物分子的方法:
[0034] 根據本發明，提供了合成化學改性的或活化的固定的生物分子的方法，該方法包 括：
[0035] (i)使生物分子在適于固定生物分子的情況下與捕獲樹脂接觸，并且因而提供固 定的生物分子;其中生物分子是抗體、改性的抗體或抗體片段;和其中捕獲樹脂包括選自下 述的生物分子捕獲部分：（1)非肽型的，包括氨基酸型的，蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L模擬 物，（2)肽型的蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L模擬物，（3)核苷酸結合位點捕獲部分和(4)糖蛋 白捕獲部分;和
[0036] 使固定的生物分子與化學改性試劑或活化試劑接觸，以提供化學改性的或活化的 固定的生物分子。
[0037] 蛋白質和更具體的抗體的綴合通常用于研究、診斷和治療。Biocon jugate Techniques，第二版(Greg T Hermanson)提供了有關形成標記的或綴合分子的化學、試劑 系統和實際應用的非常詳細的信息。也詳細描述了許多反應，其有關數百種商業上可得的 試劑和這些試劑用于改性或交聯肽和蛋白質、糖和多糖、核酸和寡核苷酸、脂質和合成聚合 物的用途。下面提供了應用于抗體的關鍵綴合化學物質的簡述。
[0038] 在還原天然鏈間二硫鍵之后綴合至游離硫巰基是抗體綴合的常用方法和商業ADC ADCetris?:采用的化學反應。方法包括使抗體接觸還原劑，比如T CEP、D T T、巰基乙胺 (merceptoethylamine)或本領域熟知的其他適當的還原劑;然后，與藥物、配體、式D-X的標 記物綴合，其中D是藥物、配體或標記物和X是活性基團，其選自馬來酰亞胺、鹵代烷、吡啶基 二硫化物和本領域已知的其他硫巰基活性化學物質。
[0039]硫巰基綴合抗體的替代方法是改造在抗體中特定位點的活性半胱氨酸殘基，以使 得藥物以限定的化學計量被綴合，而不破壞鏈間二硫鍵。改造的半胱氨酸通常作為半胱氨 酸或谷胱甘肽的混合二硫化物存在。通過完全還原隨后滲濾(虹8；^11^31：；[011)而去除加合 物。這破壞了鏈間二硫化物，其必須通過用空氣、CUS04或脫氫抗壞血酸氧化來改造。
[0040]用于綴合的另一常見位點是賴氨酸殘基的側鏈上存在的氨基基團。最簡單的方法 包括使抗體接觸藥物、配體、式D-Y的標記物或連接體。D具有如上的相同定義并且Y是活性 基團，其選自異氰酸酯、NHS酯、磺酰氯、環氧化物和本領域技術人員已知的其他試劑。
[0041 ]也通常采用間接綴合至賴氨酸。首先用雜雙官能連接體活化賴氨酸側鏈的氨基基 團，然后這與包含良好活性化學性質的藥物綴合。這樣的偶聯體的例子包括用2-亞氨基硫 烷改性賴氨酸，以產生新的硫巰基，隨后與任何上述的硫巰基活性藥物-連接體(D-X)綴合。 另一偶聯體是用SMCC改性賴氨酸，以產生結合馬來酰亞胺的賴氨酸，隨后與包含游離硫巰 基的藥物綴合。對于用于間接賴氨酸綴合的有潛力的偶聯體的完整綜述見Hermanson和 Perbio交聯劑目錄。
[0042]數個小組已經開發了以化學上與蛋白質中20種成蛋白性氨基酸側鏈正交的側鏈 并入非天然氨基酸的方法。
[0043] Redwood Bioscience(www.redwoodbioscience.com)已經開發了他們稱為酸標記 (Aldehyde Tagging)的技術。在該技術中，他們采用稱為甲酰甘氨酸酶(FGE)的天然酶，其 通常將高度保守的13氨基酸序列中的Cys殘基轉化成