一種與家蠶細胞凋亡相關的miRNA在抗病毒感染中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞生物學技術領域，尤其涉及一種與家蠶細胞凋亡相關的miRNA在 抗病毒感染中的應用。
【背景技術】
[0002] 家蠶(Bombyx mori)是世界上重要的經濟昆蟲。我國是全球最大的蠶苗、蠶絲生產 國和繭絲綢出口國（顧國達等，2002)。蠶桑業在農業經濟中占有重要地位，是農民收入的重 要來源。此外，家蠶作為生物反應器用來表達、生產外源基因具有其特有的優勢(張耀洲等， 2008)。然而，蠶病的發生與流行嚴重影響著我國蠶桑產業的可持續發展。
[0003] 其中，家香核型多角體病毒（B.mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV，一種 桿狀病毒）引起的蠶膿病作為危害最為嚴重的一種病毒病，在世界養蠶國家常有暴發，且傳 染強、難控制，并極易造成巨大的經濟損失。
[0004] 目前，我國四川、浙江、江蘇和廣東等蠶業主產區，每年由BmNPV引起蠶繭損失，約 占蠶病總損失的70~80 %。長期以來，盡管在家蠶抗病毒機理研究和抗性品種培育等方面 己取得進展，但仍有較多問題尚未解決（呂鴻聲，2008)。而且，家蠶生物反應器亦存在著寄 主范圍窄、特異性高和外源基因可能與家蠶體內對BmNPV調控機制的互作而出現基因沉默 現象等問題，嚴重制約利用家蠶生物反應器產業化開發有用蛋白的生物農場發展。
[0005] 研究表明，桿狀病毒感染能誘導寄主昆蟲細胞凋亡(Apoptosis)(龐義等，1998)， 而細胞凋亡則被認為是昆蟲防衛病毒侵染的一種重要機制，主要通過寄主細胞的自殺性死 亡以限制病毒的感染與復制（Schultz等，2009 ;Vandergaast等，2011)。在寄主細胞中存在 多種凋亡調控蛋白如凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs) (Verhagen等，2001)和API5(Apoptosis inhibitor-5)(Morris等，2006)等，可調節細胞凋 亡的發生與終止。事實上，IAPs最早是在昆蟲病毒中發現的，可阻止寄主細胞凋亡而實現病 毒復制與增殖(Clem等，2007; Sahdev等，2010)。因此，在病毒侵染早期，通過促進感染病毒 的寄主細胞發生凋亡是有效的抗病毒策略之一。
[0006] 小RNA(microRNAs，簡寫miRNA或miR)是一類長度在18~25個堿基的具有調控作用 的非編碼RNA核酸分子。小RNA在基因的轉錄后調控中起著重要作用，參與昆蟲發育、生殖、 神經發生、代謝、免疫及細胞凋亡等各種生物過程。
[0007] 研究表明，小RNA亦能參與對病毒侵染免疫反應的調控過程(Fullaondo等，2012; Hussain等，2014)。目前，已在家蠶體內發現487條小RNA前體和563條成熟的小RNA(miRBase ￥21，2014)。其中，1^〇1111?-3378最早于2010年由031￥1-]^1等人采用501^0測序技術在家 蠶全蟲和絲腺中鑒定獲得，經預測發現有43個潛在靶基因，主要涉及胚胎發育、細胞分裂、 囊泡運輸和神經受體以及腫瘤發生、病原微生物感染等，但bmo-miR-3378在家蠶體內的功 能與作用機制至今未有任何報道。
【發明內容】
[0008] 本發明發現家蠶microRNAs中的bmo-miR-3378能夠促進家蠶細胞的凋亡，并通過 家蠶細胞的凋亡來抑制家蠶細胞中桿狀病毒的增殖，從而實現對感染桿狀病毒的家蠶的防 治。
[0009] 本發明發現了bmo-miR-3378在促進家蠶細胞凋亡中的應用。
[0010] 具體地，所述的家蠶細胞為家蠶BmN細胞。
[0011] 本發明發現了bmo-miR-3378在制備抗家蠶桿狀病毒感染藥物中的應用。
[0012] 作為優選，所述桿狀病毒為核型多角體病毒。
[0013] 本發明提供了 bmo-miR-3378類似物在促進家蠶細胞凋亡中的應用，其特征在于， 所述bmo-miR-3378類似物為雙鏈RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所 不。
[0014] 本發明提供了 bmo-miR-3378類似物在制備抗家蠶桿狀病毒感染的藥物中的應用， 所述bmo-miR-3378類似物為雙鏈RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所 不。
[0015] 本發明提供了 bmo-miR-3378抑制物在抑制家蠶細胞凋亡中的應用，所述bmo-miR-3378 抑制物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 13 所示。
[0016]本發明還提供了 bmo-miR-3378抑制物在家蠶生物反應器中促進重組桿狀病毒增 殖與侵染的應用，所述bmo-miR-3378抑制物的核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示。
[0017]本發明還提供了一種家蠶桿狀病毒病的防治方法，包括:采用bmo-miR-3378或其 類似物轉染受桿狀病毒感染的家蠶細胞;所述bmo-miR-3378的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示;所述類似物的為雙鏈RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示。 [0018] 為了驗證上述發現，本發明采用qRT-PCR法明確家蠶BmN細胞感染BmNPV以及轉染 bmo-miR-3378類似物與抑制物后bmo-miR-3378表達量的變化，然后分別采用Caspase活性 檢測法、MTT法、qRT-PCR法和Reed-Muench終點稀釋法研究了bmo-miR-3378表達量變化對感 染BmNPV的家蠶BmN細胞凋亡與活力、以及BmNPV復制與致病力的影響。結果表明，bmo-mi R-3378可通過促進BmN細胞凋亡而抑制BmNPV增殖和侵染。
[0019] 具體內容如下：
[0020] 本發明采用莖環法設計、合成bmo-miR-3378特異性PCR引物，并采用qRT-PCR法檢 測比較了家蠶BmN細胞感染BmNPV后bmo-miR-3378的表達量變化。結果發現，在家蠶BmN細胞 感染BmNPV后12h和24h，bm〇-miR-3378表達量出現顯著降低(p〈0.05)。
[0021 ]隨后，發明人合成bmo-miR-3378類似物與抑制物，分別轉染家蠶BmN細胞，并采用 qRT-PCR法檢測bmo-miR-3378的表達水平。結果發現，家蠶BmN細胞轉染bmo-miR-3378類似 物后，bmo-miR-3378表達量極顯著升高(p〈0.05);而轉染bmo-miR-3378抑制物后的表達量 極顯著降低(p〈〇.〇l)。
[0022]在此基礎上，發明人對分別轉染bmo-miR-3378類似物與抑制物的家蠶BmN細胞進 行病毒感染處理，采用Caspase活性檢測法測定BmN細胞的凋亡誘導情況。結果發現，經bmo-miR-3378 類似物處理的 BmN 細胞在接毒 24h 之內 ，細胞凋亡水平顯著增高 （p〈0. 05); 而經 bmo-miR-3378抑制物處理的BmN細胞在接毒48h之內，細胞凋亡水平顯著降低(p〈0.05)。這 表明bmo-miR-3378表達量升高或降低可分別顯著誘導或抑制寄主細胞對病毒的凋亡反應。 [0023] 最后，本發明應用bmo-miR-3378類似物與抑制物處理家蠶BmN細胞，然后分別采用 MTT法評價BmN細胞活力、采用qRT-PCR法評價BmNPV在處理細胞中的增殖力和采用Reed-Muench終點稀釋法評價處理細胞中BmNPV的感染力等。結果表明，經bmo-miR-3378類似物處 理的BmN細胞感染BmNPV后：細胞活力明顯降低，且在接毒24h以后差異達到顯著水平（p〈 〇. 05);細胞中的BmNPV的DNA拷貝數在接毒72h內均顯著降低(p〈0.05); BmNPV的滴度亦顯著 降低(p〈0.05)。與此對應，經bmo-miR-3378抑制物處理的BmN細感染BmNPV后，相關的指標均 呈現相反變化。
[0024] 上述結果表明，bmo-miR-3378可通過調控寄主細胞凋亡而影響病毒的復制與侵 染。因此，bmo-miR-3378可作為雙向調控分子而應用于促進或抑制病毒在寄主細胞中的侵 染與增殖。
[0025]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0026] 本發明發現bmo-miR-3378在家蠶BmN細胞感染BmNPV的過程中表達量顯著降低，說 明其在病毒與寄主互作中的具有特定的功能;并通過實驗證明bmo-miR-3378能夠通過調控 BmN細胞的凋亡，進而影響病毒的增殖與侵染，其可以作為調控桿狀病毒感染的新的小RNA， 對當前蠶業生產中的家蠶抗病毒防治與育種以及促進家蠶生物反應器產業化發展具有重 要的現實意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1為BmNPV感染對家蠶BmN細胞中bmo-miR-3378表達量影響的qRT-PCR檢測結果 示意圖。圖中結果表明，家蠶細胞在感染病毒早期(24h內），bm〇-miR-3378表達量出現顯著 降低(p〈0.05)。
[0028] 圖2為bmo-miR-3378類似物對家蠶BmN細胞中bmo-miR-3378表達量影響的qRT-PCR 檢測結果示意圖。結果表明，家蠶細胞在轉染bmo-miR-3378類似物后，bmo-miR-3378表達量 呈極顯著增高(P〈〇. 01)。這說明bmo-miR-3378類似物的處理具有bmo-miR-3378過表達的效 果。
[0029] 圖3為bmo-miR-3378抑制物對家蠶BmN細胞中bmo-miR-3378表達量影響的qRT-PCR 檢測結果示意圖。結果表明，家蠶細胞在轉染bmo-miR-3378抑制物后，bmo-miR-3378表達量 呈極顯著降低(p〈〇. 01)。這說明bmo-miR-3378類似物處理具有bmo-miR-3378抑制沉默的效 果。
[0030] 圖4為bmo-miR-3378類似物對家蠶BmN細胞誘導凋亡影響的Caspase活性檢測結果 示意圖。結果表明，經bmo-miR-3378類似物