神經干細胞在介導影響p25和p35蛋白表達中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥技術領域。更具體地，涉及神經干細胞在介導P25和P35蛋白表達從而促進缺血缺氧性腦病新生大鼠神經功能恢復方面的應用。
【背景技術】
[0002]圍產期窒息所致缺氧缺血性腦病(hypoxic-1schemic encephalopathy，HIE)是一種常見的腦損傷疾病，該病是新生兒期危害最大的常見病之一，常引起新生兒死亡和嚴重神經系統發育障礙。據統計，我國新生兒HIE發生率約為活產兒的3%。?6%。，其中15%?20%在新生兒期死亡，存活者中20%?30%可能遺留不同程度的神經系統后遺癥。另外，還有包括阿爾茨默氏病、肌萎縮側索硬化癥、帕金森病等各種神經變性疾病，已嚴重威脅人類的健康，
目前為止，針對腦損傷和神經系統變性性疾病，尚無有效的治療手段。研究顯示，P35和P25蛋白是細胞周期素依賴蛋白激酶5(Cdk5)的調節亞基，Cdk5在哺乳動物海馬神經元的學習和記憶功能中發揮重要作用。生理狀態下，CDk5在p35等調節亞基的信號作用下錨定于膜上，磷酸化膜性底物，通過平衡促凋亡和促存活信號轉導通路，在神經元發育、迀移、神經元存活中發揮重要作用。也有研究顯示，P35蛋白是大腦皮層中cdk5的特異性激活劑，能夠被鈣激活中性蛋白(calpain)分解為P25并與cdk5結合使之激活，參與神經細胞的歉意、分化、細胞凋亡和信號傳導等過程。而Cdk5在多種人類神經退行性疾病中起非常重要的作用，可能是構成包括阿爾茨默氏病、肌萎縮側索硬化癥、帕金森病等神經變性疾病的主要分子病理基礎。
[0003]因此，針對P35和P25蛋白的調控從而治療相關的腦損傷和神經變性疾病，是一種探索腦類疾病治療藥物的新方向和有效途徑。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是克服現有HIE等腦損傷或神經變性疾病治療技術的缺陷和不足，提供一種能夠針對調控P35和P25蛋白的表達，從而實現HIE等腦損傷或神經變性疾病治療目的的藥物。本發明研究顯示，神經干細胞(neural stem cells，NSC)能夠調控P25、P35蛋白的表達變化，具體是上調P35蛋白表達、下調P25蛋白表達，抑制Cdk5的過度激活，從而對腦損傷起到保護治療作用，對缺血缺氧性腦病等疾病有顯著的療效。
[0005]本發明的目的是提供神經干細胞在制備P25和/或P35蛋白表達調控劑方面的應用。
[0006]本發明另一目的是提供神經干細胞在制備腦損傷或神經變性疾病治療藥物方面的應用。
[0007]本發明再一目的是提供神經干細胞在制備缺血缺氧性腦病治療藥物方面的應用。
[0008]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
神經干細胞在制備P25和/或P35蛋白表達調控劑方面的應用。
[0009]具體地，是神經干細胞在制備P25蛋白表達抑制劑方面的應用，以及神經干細胞在制備P35蛋白表達促進劑方面的應用。
[0010]神經干細胞在制備腦損傷或神經變性疾病治療藥物方面的應用。
[0011]其中，所述腦損傷或神經變性疾病是指P25和/或P35蛋白參與調控的腦損傷或神經變性疾病。
[0012]更具體地，所述腦損傷或神經變性疾病是指缺血缺氧性腦病
另外，在針對缺血缺氧性腦病治療藥物時，所述藥物是指能夠保護和/或恢復腦缺血損傷的藥物。
[0013]更進一步地，所述藥物是指能夠保護和/或恢復腦缺血損傷，且能夠上調P35蛋白表達、下調P25蛋白表達的藥物。
[0014]本發明為了探討神經干細胞對P25、P35蛋白表達變化的影響，以及對缺血缺氧性腦病新生大鼠的治療作用，選取了60只新生7天SD大鼠，按隨機數表法分為3組:SHAM組(對照組):20只，按HIE模型制作過程施予假手術，不給予其他干預。HIE+PBS組(缺血組):20只，先制成HIE模型，然后給予I3BS作為安慰治療;HIE+NSC組(治療組)20只，先制成HIE模型，然后給予NSC治療。分別于干預后第5、7、14、21天進行神經行為學檢測(Rotarod Test旋轉實驗和Morris水迷宮測試)。21日后處死采用組織切片HE染色，觀察新生大鼠腦損傷的病理變化。組織勻漿法提取海馬蛋白，Western blot法檢測海馬區P35、P25蛋白的表達。
[0015]Rotarod Test結果顯示造模后第5天模型組與治療組大鼠在轉輪中堅持時間明顯下降，與對照組比較差異有統計學意義(P〈0.05);造模后第7、14、21天，模型組與治療組大鼠在轉輪中堅持時間明顯升高，其中治療組升高趨勢明顯高于缺血組(P〈0.05)，第21天模型組與治療組大鼠在轉輪中堅持時間比較差異有統計學意義(P〈0.0ShMorris水迷宮結果顯示3大鼠的逃避潛伏期隨訓練天數增加而逐漸縮短，前5天的總體學習成績的組間差異有統計學意義(P〈0.01)。第7天開始治療組時間逐漸縮短，第21天治療組與缺血組大鼠的逃避潛伏期在各個時間點的差異均有統計學意義(P〈0.05)。模型組大鼠出現海馬區神經元水月中、核染色質結構不清、空泡形成等病理變化，而治療組病理損傷明顯減輕。Western blot結果顯示與對照組相比缺血組P35表達減少，P25表達增加(P〈0.05)，而治療組與缺血組相比較P35表達增多，P25表達減少(P〈0.05)。
[0016]綜上所述，顯示，神經干細胞(neural stem cells，NSC)能夠調控P25、P35蛋白的表達變化，具體是上調P35蛋白表達、下調P25蛋白表達，抑制Cdk5的過度激活，從而對腦損傷起到保護治療作用，可促進大鼠缺血腦損傷后神經功能恢復，對缺氧性腦病等疾病有顯著的療效。因此，上述應用均應在本發明的保護范圍之內。
[0017]本發明具有以下有益效果:
本發明研究顯示，神經干細胞(neural stem cells，NSC)能夠調控P25、P35蛋白的表達變化，具體是上調P35蛋白表達、下調P25蛋白表達，抑制Cdk5的過度激活，從而對腦損傷起到保護治療作用，對缺血缺氧性腦病等疾病有顯著的療效。
[0018]本發明為HIE等腦損傷或神經變性疾病的治療提供了一種新的治療途徑和藥物開發基礎，給缺血缺氧性腦病等相關疾病患者帶來新希望。
[0019]另外，本發明還為研究Cdk5在HIE腦損傷中的作用及神經干細胞的治療機制提供了新思路，研究結果揭示了Cdk5在HIE腦損傷中發揮促凋亡作用，而神經干細胞可以阻斷 Cdk5及其信號轉導通路從而預防或減輕HEI腦損傷。
【附圖說明】
[0020]圖1為3組大鼠造模后不同時間點旋轉試驗檢測結果。
[0021]圖2為3組大鼠造模后不同時間點逃避潛伏期檢測結果。
[0022]圖3為3組大鼠造模后第21天海馬腦片HE染色結果(200倍)。
[0023]圖4為3組大鼠海馬P35和P25蛋白表達電泳圖。
[0024]圖5為3組大鼠海馬P35和P25蛋白定量表達分析結果(*表示P〈0.05)。
【具體實施方式】
[0025]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0026]本發明實施例部分的統計學方法采用SPSS13.0統計軟件處理。計量資料采用均數土標準差表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Student’s t-test進行檢驗。以P〈0.05為差異有統計學意義。
[0027]實施例1
1、實驗動物及分組:
選擇7日齡SD大鼠60只，雌雄各半，體重50-60g，由南方醫科大學實驗動物中心提供(SYXK(粵)2011-0074)，按隨機數字表法分為3組:
(1)HIE+PBS組(缺血組):20只，HIE造模成功后PBS作為安慰治療；
(2)SHAM組(對照組)；20只，僅按HIE模型制作過程施予假手術，不給予其他干預；
(3)HIE+NSC組(治療組):20只，HIE造模成功后給予NSC治療。
[0028]2、主要儀器設備與試劑
(I)主要儀器:轉棒儀(Rotarod，濟南益延科技發展有限公司，YLS-4C);RD1101-MWM-G鼠博士 MORRIS水迷宮視頻分析系統(上海移數信息科技有限公司)；海力孚HF-240全自動生化分析儀;立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，68000型);微量注射栗(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，KdSientific 310);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，CX31);電泳儀(瑞典Amersham公司；Ettan DALTsix)；低溫離心機/凝膠圖像分析儀(美國安萊公司，AlphaEmager2200)。
[0029](2)主要試劑:蛋白酶抑制齊Ij cocktail購自美國sigma公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。P25/P35(C-19)多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；β-actin購自威佳公司；辣根過氧化物酶標記二抗購自中杉金橋公司;Westernblot化學發光檢測試劑盒購自凱基生物公司；神經干細胞由廣東省臍帶血造血干細胞庫提供，移植時PBS洗滌細胞3次，終濃度調節為