葉酸特異性靶向活化態肝星狀細胞的聚合物納米載體及其藥用用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物輸送領域。具體設及一種祀向活化態肝星狀細胞的聚合物納米載 體及其制備和應用。
【背景技術】
[0002] 我國是肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝臟疾病的高發區，其肝癌發病率和死亡率都超 過了全球的50%。肝硬化和肝癌的發病率呈正相關關系，肝纖維化作為肝硬化的前期重要 病癥，受到越來越多研究者關注。肝纖維化的形成設及到肝細胞化C)、肝星狀細胞化SC)、陷 窩細胞、庫普弗細胞化C)和肝竇內皮細胞(SLEC)等，而靜止態向肌纖維化樣活化態轉變后 的肝星狀細胞化epatic stellate cell,HSC)被認為是肝纖維化起始過程的中屯、環節。隨 著細胞學和分子生物學的發展和應用，WHSC為祀點來研發抗肝纖維化藥物成為肝病治療 領域的熱點。已相繼有人嘗試紫杉醇、姜黃素、NO類等藥物來抑制活化態HSC的增殖和ECM的 沉積，也有采用RNAi技術針對I型膠原蛋白基因進行沉默的成功報道。
[0003] 無論是化學藥物還是基因藥物，它們大多或者水溶性差、藥效低下、價格不菲，或 者穩定性低、在體內容易被降解;而且其作用的非特異性，常常導致低藥效、高毒副作用。運 些問題的存在都極大地限制它們在臨床中的應用。W納米載體系統載送藥物不僅可解決藥 物難溶性和穩定性低的問題，還可W通過EPR效應有效地使藥物在肝臟部位富集、改善細胞 對藥物的攝取。近年來已有一些納米載體藥物系統用于肝纖維化、肝硬化和肝癌的診斷和 治療的報道，成功載送了肝臟生長因子化GF)、N0藥物及中草藥等至纖維化小鼠肝臟；國內 李玉娟等人也研發了 W多聚體和脂質體為主的納米載送顆粒、嘗試對肝纖維化和肝癌的治 療。然而，運些納米粒子載體都不能有效地祀向性作用于活化服C-運一類主要的導致肝纖 維化的細胞;過量的納米粒子對肝臟形成毒性。與普通藥物治療相比，HSC細胞特異性的祀 向藥物載體能夠延長藥物的體循環時間、提高藥物在HSC中的富集、而且可降低藥物劑量、 進一步減少毒副作用，是目前肝纖維化治療中亟待發展的一類藥物載體系統。
[0004] 目前可特異性作用于HSC藥物載體主要有幾種：如甘露糖6憐酸人血清白蛋白 (16口-服4)脂質體，參見：4化1曰11]\6.,?0613付3 1(.,5油61'曲(^6丄.，6131.1]116腳。1：；[0]1 of targeted liposomes with primary cultured hepatic stellate cells: Involvement of multiple receptor systems[J].Journal of hepatology,2006,44(3): 560-7;含有RGD序列環膚祀向長循環脂質體(RGD-SSL)，參見:Du S丄.，Pan H. ,Lu W.Y.，et al.Cyclic Arg-Gly-Asp peptide-labeled liposomes for targeting drug therapy of hepatic fibrosis in rats[J]. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics , 2007,322(2): 560-8;偶聯維生素 A的聚合物納米載體，參見:Duong H. T., Dong Z.,Su L.,et 曰I.The use of nanoparticles to deliver nitric oxide to hep曰tic stell曰te cells for tre曰ting liver fibrosis 曰nd port曰I hypertension
[J].Small, 2015,11(19) :2291-304;偶聯識別血小板衍生生長因子受體的環膚共聚物，參 見：Bansal R.,Prakash J.,Post E.,et al.Novel engineered targeted interferon-gamma blocks hepatic fibrogenesis in mice[J].Hepatology,2011,54(2):586-96。運 四者都W肝星狀細胞表達的受體為祀位點，利用受體配體間的特異性結合實現對HSC的主 動祀向。但是，前兩種載體所識別的受體均在其他細胞中有所表達，導致載體在祀向肝星狀 細胞過程中也作用于其它正常細胞;且配體制備過程較為復雜、成本高昂，不利于臨床進一 步研究和利用。此外，靜止態HSC也大量攝取維生素 A，因此維生素 A修飾的載體系統不具備 對活化態HSC的特異性作用。而能特異性識別血小板衍生生長因子受體的環膚共聚物，其合 成困難、成本高昂。因此，開發一種特異性祀向活化態HSC的高效、低毒性、低成本的藥物載 體對肝纖維化的研究和治療有著積極而重要的意義。
[0005] 葉酸受體是一種腫瘤細胞表面高表達而正常細胞低表達的糖蛋白，作為其特異性 配體的葉酸，具有分子量低、易化學修飾、穩定性好、無免疫原性、和受體親和性強W及成本 低廉等突出優點。因此，葉酸漸漸成為腫瘤祀向的理想配體，近年來在藥物祀向輸送、癌癥 治療等領域引起了廣泛的關注。我們研究組發現，與靜止的肝星狀細胞相比，快速增殖的活 化態肝星狀細胞中葉酸受體的表達顯著增強；和腫瘤組織間質類似，肝纖維化部位由于活 化肝星狀細胞旺盛的糖酵解而產生大量代謝酸性產物，使肝纖維化細胞間質pH呈弱酸性 等。運些生理學上的類似特征啟發我們采用偶聯葉酸的聚合物納米膠束實現對活化態HSC 進行主動祀向。目前，尚未有特異性祀向肝星狀細胞的偶聯葉酸配體聚合物納米載體的相 關報道。
【發明內容】
[0006] 鑒于現有技術的W上不足，本發明的目的在于，克服現有作用于活化態肝星狀細 胞藥物載體的不足，提供一種新型的、具有特異性祀向活化態肝星狀細胞功能的聚合物納 米載體。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用一種葉酸祀向的聚合物納米載體，其化學結構式如 下：
式中，n = 41~50,m=12~14。所述納米載體為球形，粒徑均勻且平均粒徑為50-60nm。
[0009] 所述葉酸祀向活化態肝星狀細胞的聚合物納米載體為納米膠束，其親水段材料為 聚乙二醇，其分子量為1800~2200，疏水段材料為聚己內醋，其分子量為1368~1596。
[0010] 所述納米膠束粒徑較小，分布均勻，具有良好的穩定性和生物相容性，可W有效地 祀向肝纖維化部位從而實現富集給藥。
[0011] 本發明的另一目的是將上述聚合物納米膠束用于特指的藥用用途，即：
[0012] 葉酸祀向活化態肝星狀細胞的聚合物納米膠束的藥用用途，在所述聚合物納米膠 束疏水段形成的內核包覆尼羅紅等疏水性巧光染料和疏水性抗纖維化藥物，進而考察偶聯 葉酸配體的聚合物納米載體對活化態肝星狀細胞的祀向效果和藥物作用，用作肝纖維化的 祀向治療和研究。本發明所述的納米膠束結構是核殼結構，外殼的親水段末梢接枝祀向配 體，內核的疏水段可包覆疏水性巧光染料及抗纖維化藥物。
[0013] 本發明提供了一種特異作用于活化態肝星狀細胞的聚合物納米載體的制備和應 用。我們首次發現，在由靜息態到肌纖維化樣活化態的轉型過程中，肝星狀細胞中a型葉酸 受體的表達顯著增強。進一步制備葉酸偶聯的聚合物納米膠束載體，我們成功實現了其對 活化態的原代大鼠肝星狀細胞及細胞株的特異性祀向。本發明所述的藥物納米載體系統采 用聚乙二醇為親水段材料，確保其對血液循環中蛋白質吸附和細胞粘附的抵抗；W聚己內 醋為疏水段材料成核，便于多種疏水性抗纖維化藥物及巧光染料的裝載。偶聯于PEG外殼上 的葉酸則保證載體系統對活化態肝星狀細胞表面的葉酸受體進行特異性地識別，最終有效 地提高藥物的利用率并降低其毒副作用。
【附圖說明】：
[0014] 圖1為本發明所用原代大鼠肝星狀細胞(HSC)靜息態到活化態mRNA表達量變化。其 中：圖1 (a)為aSMA的mRNA變化量，圖1 (b)為Co 1 Iagen Ia 1的mRNA變化量，圖1 (C)為FR-a的 mRNA變化量。
[001引圖2為本發明所用FA-PEG-PCL聚合物材料合成路線圖。
[0016]圖3為本發明所用FA-PEG-PCL聚合物材料Ih-NMR圖譜。
[0017 ]圖4為本發明所用FA-PEG-PCL納米膠束粒徑分布。
[0018]圖5為本發明所用FA-PEG-P化納米膠束透射電鏡照片。
[0019 ]圖6為本發明所用FA-PEG-PCL納米膠巧臨界膠束濃度現慢曲線。
[0020]圖7為本發明所用納米膠束對服C-T6細胞毒性實驗。
[0021 ]圖8為本發明所用服C-T6細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束巧光照片。
[0022] 圖9為本發明所用HSC-T6細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束流式細胞儀定量分析。
[0023] 圖10為本發明所用服C細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束巧光照片。
[0024] 圖11為本發明所用HSC細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束流式細胞儀定量分析。
【具體實施方式】
[0025] 基于開發一種新型、高效、低毒性、低成本并能特異性祀向HSC的藥物載體，使之對 肝纖維化的治療具有明確的祀向效果的發明目的，設計了祀向環境和效率、聚合物材料的 制備和評價、聚合物納米膠束的獲取實驗環節。考慮到尼羅紅(Nile Red)作為一種獨特的 疏水性巧光染料，在水溶液中巧光強度非常低，而在疏水環境中會發出強烈巧光，在細胞成 像、生物診斷及檢測等應用非常廣泛。此外，尼羅紅在分子量、親疏水性W及藥物穩定性等 方面與疏水性藥物非常相似，是一種非常理想的巧光標記染料和疏水性藥物模型，所W我 們采用尼羅紅作為巧光染料和疏水性藥物模型來驗證偶聯葉酸配體聚合物納米載體對活 化態肝星狀細胞的祀向性和藥物作用。并W尼羅紅為疏水性藥物模型和祀向效果檢測標識 進行定性和定量評價。將上述內容構成實施例，下面結合各實施例和附圖做進一步說明。
[0026] 實施例1
[0027] 原代大鼠肝星狀細胞化SC)的分離和培養
[0028] 采用原位灌注法消化大鼠肝臟，對消化分離得到的原代大鼠肝星狀細胞采用高糖 DMEM培養基(含15 % -20 % FBS，1 %雙抗P/S)置于37 °C，5 % C〇2細胞解箱中培養。
[0029] 實施例2
[0030]活化態大鼠肝星狀細胞化SC-T6)的培養
[0031 ] 對HSC-T6細胞進行復蘇傳代后加入高糖DMEM培養基(含10 % FBS，1 %雙抗P/S)后 置于37°C，5%C02細胞解箱中培養。
[0032] 實施例3
[0033] 原代大鼠肝星狀細胞(HSC)由靜息態到活化態aSMAXollagenlal、FR-a的mRNA表 達量變化分析
[0034] 采用原位灌注法消化大鼠肝臟，對消化分離得到的原代大鼠肝星狀細胞在24孔板 中培養7天，其后吸除24孔板培養