用于治療口炎性腹瀉的組合物和方法
【專利說明】用于治療口炎性腹瀉的組合物和方法
[0001 ]相關申請
[0002] 本申請要求2013年8月14日提交的美國臨時專利申請序列號61/865,787的優先 權，該申請的全部內容通過引用并入本申請中。
[0003] 聯邦資助聲明
[0004] 本發明是在國防高級研究計劃局給予的HR0011-08-1-0085的政府支持下完成的， 政府享有本發明的某些權益。
【背景技術】
[0005] 口炎性腹瀉(celiac sprue)是一種極常見的疾病，該病是在小麥、大麥、黑麥產品 中發現的被稱為"麩質"的食用蛋白質在遺傳學上易感染個體的小腸中引起的免疫反應。由 此導致的炎癥會造成小腸絨毛的退化，阻礙營養物的吸收。其癥狀會在兒童早期或人生的 后期出現，嚴重程度分布廣泛，從腹瀉、疲勞、體重減輕到腹脹、貧血及神經癥狀。目前對這 種伴隨終生的疾病尚沒有有效的治療方法，只能從飲食中完全排除麩質。盡管仍有很大一 部分口炎性腹瀉未被檢測出來，但該病在美國和歐洲的患病率據估計占人口的〇. 5-1.0 %。 由于要在人類消化道的惡劣及強酸環境下特異性地、有效地降解麩質源性肽有著嚴苛的物 理和化學要求，很難找到合適的自然產生的酶以口服療法治療口炎性腹瀉。
【發明內容】
[0006] 在一個方面，本發明提供了用于治療口炎性腹瀉的方法，包括給患有口炎性腹瀉 的患者施用有效量的用于治療口炎性腹瀉的一種或多種多肽，所述一種或多種多肽包括選 自由 SEQ ID 5:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其經加工的版本（口『〇。6886(1 version)組成的組中的多肽的氨基酸序列，或由選自由SEQIDN0S:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其經加工的版本組成的組中的多肽的氨基酸序列組成。在一個實施例中，所 述一種或多種多肽包括包含了選自由SEQ ID勵8:75、74、77、78、82、88、98、105、111或其經 加工的版本組成的組中的多肽的氨基酸序列的一種或多種多肽，或者由選自由SEQ ID N0s:75、74、77、78、82、88、98、105、lll或其經加工的版本組成的組中的多肽的氨基酸序列 組成的一種或多種多肽。在進一步的實施例中，所述一種或多種多肽包括含有SEQ ID NO: 89的氨基酸序列的多肽。
[0007] 在另一方面，本發明提供了分離的多肽，其選自由以下多肽或其經加工的版本組 成的組：
[0008] (a)SEQ ID N0:95,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基116是V或D; (i i)AA殘基255是S、Κ或G; (ii i)AA殘 基284是D; (iv)AA殘基285是T; (V)AA殘基286是A、T或N; (vi)AA殘基312是S; (vii)AA殘基 347 是 N; (viii)AA 殘基 350 是 T或A;(ix)AA 殘基 351 是N 或 G; (X)AA 殘基 354是DjP(Xi)AASS 361是S或H;
[0009] (b)SEQ ID N0:75,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基106是D; (ii)AA殘基246是S、K或G; (iii)AA殘基 275是D; (iv)AA殘基276是S; (V)AA殘基277是A、T或N; (vi)AA殘基303是S; (vii)AA殘基338 是 S; (viii)AA殘基 341 是T或 A; (ix)AA殘基 342 是 N或 G; (X)AA殘基 345 是Q 或DjP(Xi)AASS 352是S或H;
[0010] (c)SEQ ID NO:76,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基120是D; (ii)AA殘基259是S、K或G; (iii)AA殘基 288是D; (iv)AA殘基289是T; (V)AA殘基290是A、T或N; (vi)AA殘基316是S; (vii)AA殘基351 是S或N; (viii)AA殘基354是A;(ix)AA殘基355是N或G; (X)AA殘基358是D;和(xi)AA殘基365 是S或H;
[0011] (d)SEQ ID N0：78；
[0012] (e)SEQ ID N0:79,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基107是V或D; (ii)AA殘基245是S、K或G; (iii)AA殘 基274是D; (iv)AA殘基275是T; (V)AA殘基276是A、T或N; (Vi)AA殘基302是S; (Vii)AA殘基 337 是 S或N; (viii)AA 殘基 340 是T或 A;(ix)AA 殘基 341 是N 或G; (X)AA 殘基 344是Q或DjP(Xi) AA殘基351是SSH;
[0013] (f)SEQ ID N0:80,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i )AA殘基76是V或D; (ii )AA殘基206是S、K或G; (iii)AA殘基 235是D; (iv)AA殘基236是S; (V)AA殘基237是A、T或N; (vi)AA殘基262是S; (vii)AA殘基297 是 S或N; (viii)AA殘基 300 是 T或 A; (ix)AA殘基 301 是N或G; (X)AA殘基 302 是 Q或DjP(Xi)AA 殘基309是SSH;
[0014] (g)SEQ ID N0:81，其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基105是D; (ii)AA殘基244是S或K; (iii)AA殘基272 是D; (iv)AA殘基273是S; (V)AA殘基274是A、T或N; (vi)AA殘基299是S; (vii)AA殘基334是N; (viii)AA殘基337是T或A;(ix)AA殘基338是N或G; (X)AA殘基341 是Q或D;和(xi)AA殘基348 是S或H;
[0015] (h)SEQ ID N0:82,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基106是V或D; (ii)AA殘基244是S、K或G; (iii)AA殘 基273是D; (iv)AA殘基274是T; (V)AA殘基275是A、T或N; (Vi)AA殘基301 是S; (Vii)AA殘基 336 是 N; (viii)AA 殘基 339 是 T或A; (ix)AA 殘基 340 是N 或 G; (X)AA 殘基 343 是DjP(Viii)AAS 基350是S或H;
[0016] (i)SEQ ID N0:83,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基107是V或D; (ii)AA殘基245是S、K或G; (iii)AA殘 基274是D; (iv)AA殘基275是T; (V)AA殘基276是A、T或N; (Vi)AA殘基302是S; (Vii)AA殘基 337 是N; (viii)AA 殘基 340 是 T或 A; (ix)AA 殘基 341 是N 或G; (X)AA 殘基 344 是 Q 或DjP(Xi)AA 殘基351是SSH;
[0017] (j)SEQ ID N0:84,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基104是V或D; (ii)AA殘基241是S、K或G; (iii)AA殘 基270是D; (iv)AA殘基271是S; (V)AA殘基272是D、A、T或N; (vi)AA殘基398是S; (vii)AA殘基 33是S; (viii)AA殘基336是A; (ix)AA殘基337是N或G; (X)AA殘基340是D;和(xi)AA殘基347 是S或Η;
[0018] (k)SEQ ID Ν0:85,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基104是D; (ii)AA殘基245是S、K或G; (iii)AA殘基 274是D; (iv)AA殘基275是S; (V)AA殘基276是A、T或N; (vi)AA殘基302是S; (vii)AA殘基337 是 S或N; (viii)AA殘基 340 是 T或 A; (ix)AA殘基 341 是N或G; (X)AA殘基 344 是 Q或DjP(Xi)AA 殘基351是SSH;
[0019] (I)SEQ ID N0:86,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基118是V或D; (ii )AA殘基250是K或G; (ii i )AA殘基 279是D; (iv)AA殘基280是S; (V)AA殘基281 是A、T或N; (vi)AA殘基307是S; (vii)AA殘基342 是 S 或N; (viii)AA殘基 345 是 A;(ix)AA 殘基 346 是N 或G; (X)AA 殘基 349 是 Q或 DjP(Xi)AASS 356是S或H;
[0020] (m)SEQ ID N0:87,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個或所有十一個為真：（i)AA殘基121是V或D; (i i)AA殘基253是S、Κ或G; (ii i)AA殘 基282是D; (iv)AA殘基283是S; (V)AA殘基284是A、T或N; (vi)AA殘基310是S; (vii)AA殘基 345 是 S; (viii)AA 殘基 348 是 T或 A; (ix)AA 殘基 349 是N 或G; (X)AA 殘基 352 是 Q 或DjP(Xi)AA 殘基357是SSH;
[0021 ] (n)SEQ ID N0:88,其中下述中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個或所有十個為真：（i)AA殘基111是S、K或G; (ii)AA殘基139是D; (iii)AA殘基140是T或 S; (iv)AA殘基 141是D、A、T或N; (V)AA殘基 164是S; (vi)AA殘基 199是S或N; (vii)AA殘基202 是T或A; (viii)AA殘基203是N或G;(ix)AA殘基204是Q或D;和(X)AA殘基211是S或H;和
[0022] (o)SEQ ID NO:89。
[0023] 在其他方面，本方面提供了編碼本發明的多肽的核酸，核酸表達載體包括本發明 的分離的核酸，重組宿主細胞包括本發明的核酸表達載體。
[0024] 在又一方面，本發明提供了組合物，包括：
[0025] (a)-種或多種多肽，包括選自由SEQ ID N0s:74-89、95、97-99和102-111或它們 經加工的版本組成的組中的多肽的氨基酸序列;和
[0026] (b)-種或多種其他多肽，包括選自由下述氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列：
[0027] (A)與SEQ ID N0:35的氨基酸序列至少75%相同的氨基酸序列，其中：
[0028] (i)所述多肽在pH為4時降解PQPQLP(SEQ ID N0:34)肽;和
[0029] (ii)殘基 278是 Ser，殘基 78 是 Glu，殘基 82 是 Asp;
[0030] (B)與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列至少75%相同的氨基酸序列，其中：
[0031 ] (i)所述多肽在pH為4時降解PQPQLP(SEQ ID N0:34)肽;和
[0032] (i i)殘基467 是 Ser，殘基 267 是 Glu，殘基 271 是 Asp。
[0033] 在又一方面，本發明提供了藥物組合物，包括本發明的分離的多肽、核酸、表達載 體、宿主細胞或組合物，與藥學上可接受的載體。
【附圖說明】
[0034]圖1是示出了各種多肽切斷結合了熒光基團和淬滅基團的麥醇溶蛋白的熒光類似 物的活性的圖表。X-軸:特異性同源物數目。KWT=Kumamo I i S in-As。Y-軸:任意的酶單位。
[0035]圖2是示出了在不同的pH水平下多肽切斷麥醇溶蛋白的熒光類似物的活性的圖 表。SC PEP:源自莢膜鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas capsulata)的脯氨酰內肽酶。WT: Kumamo I i s in-As Jax: KumaMax?。藍條代表在所示pH水平下最佳的蛋白酶活性。
[0036]圖3是示出了不同的多肽切斷作為麩質降解產物的兩種肽的活性的圖表。X-軸是 以分鐘計的時間，Y -軸是殘余肽片段。Max = KumaMax?;K3 = Kumamolisin-As活性位點突變 株；H4M=同源物4(SEQ ID N0:75)KumaMax?-突變株；33 = 33mer肽（SEQ ID N0:72);26 = 26mer肽（SEQ ID N0:73)。
[0037]圖4是示出了不同的其他多肽切斷麩質的33mer肽降解產物（SEQ ID N0:72)的活 性的圖表。
[0038] 詳細說明
[0039]所有引用的參考文獻的全部內容通過引用并入本申請中。在本申請中，除非另有 說明，采用的技術能夠在任意公知的參考文獻中找到，比如:Molecular Cloning(分子克 隆）：A Laboratory Manual(Sambrook,et al·，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methods in Enzymology，Vol·185，edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,San Diego,CA),"Guide to Protein Purification"in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)Innis,et al.1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene Transfer and Expression Protocols ,pp. 109-128,ed.E. J.Murray,The Humana Press Inc. ,Clifton,N.J.)，以及 the Ambion 1998Catalog(Ambion，Austin，TX)〇
[0040] 除非本申請另有明確地說明，本申請中使用的單數形式的"一(a)"、"一個(an)"和 "所述(the)"包括復數指代。本申請中使用的"和"能夠也"或"互換使用，除非另有明確地說 明。
[0041] 本申請中使用的氨基酸殘基采用如下縮寫:丙氨酸(Ala;A)，天冬酰胺(Asn;N)，天 冬氨酸(Asp;D)，精氨酸(Arg;R)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酸(Glu;E)，谷氨酰胺(Gln;Q)，甘 氨酸(Gly;G)，組氨酸(His;H)，異亮氨酸（Ile;I)，亮氨酸(Leu;L)，賴氨酸(Lys;K)，蛋氨酸 (Met ;M)，苯基丙氨酸(Phe ;F)，脯氨酸(Pro ;P)，絲氨酸（Ser ;S)，蘇氨酸(Thr ;T)，色氨酸 (Trp;W)，酪氨酸(Tyr;Y)和纈氨酸(Val;V)。
[0042] 本發明任意方面的所有實施例能夠結合使用，除非本申請另有明確地說明。
[0043] 在第一方面，本發明提供了用于治療口炎性腹瀉的方法，包括給患有口炎性腹瀉 的患者施用有效量的用于治療口炎性腹瀉的一種或多種多肽，所述一種或多種多肽包括選 自由下述組或其經加工的版本組成的組中多肽的氨基酸序列，或由選自由下述組或其經加 工的版本組成的組中的多肽的氨基酸序列組成。
[0044] 同源物1
[0045] MAPSDVEIVDPVAPEERITVTVLLRRRSSIPDQLIEGPDTLSRAELADRHGADPADVEAVRVAMSGAGLTVVGTDLP SRRVTVAGTAEALMRTFGAELQIVRDASGFQHRARSGELRIPAALDGIVIAVLGLDNRPQAEARFRASQPEAARSFR PDALGRVYRFPANTDGTGQTIAIVELGGGFRQSELDTYFGGLGIPAPQVLAVGVDGGQNLPSGDAGSADGEVLLDIE VAGALAPGARQVVYFAPNTDRGFVDAVTTAVHADPTPAAVSISWGAPEDKWTAQARRAFDAALADAAALGVTVTAAA ⑶RGSADGEGGGGLHTDFPASSPHLLACGGTKLAVADGGTVASETVWNGGERGGATGGGVSVAFGLPAYQRNAGVDK RRKTGKPGRGVPDVAAVADPATGYEVLVDGEQLVFGGTSAVAPLWAALVARLTQALGRPLGLLNTALYDGAQPGRTQ PGFRDVTEGDNDISGKHGPYPARAGffDACTGLGVPDGEALLAALRKPGKE(SEQ ID NO:74)；
[0046]同源物2 [0047] mqrgtkeglnmarhlqadreprivpeskclgqcdpaerihvumlrrqeegqldalvhqlatgdarakpvsrdafaq RFSANPDDIRKTEDFAHRHQLTVDRVDPVESVVVLSGT(I/V/D) AQFEAAFSVKLERFEHRSIGQYRGRSGPIVLPDDIGDAVTAVLGLDSRPQARPHFRFRPPFKPARGAAAVTFTPIQL ASLYDFPAGDGAGQCIAIIELGGGYRAADIQQYFRGLGITTPPKLVDVNVGTGRNAPTGEP(N/S/K/G) GPDGEVALDIEIAGAIAPAAKIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFIQAVNAAVTDKTNQPSVISISff(G/S) GPEAIffQAQSAQAFNRVLQAAAAQGITVCAASGD(S/N)GS(G/T/A)(D/N/G)GL(Q/D)DGADHV(D/S/H) FPASSPYVLGCGGTQLDALPGQGIRSEVTWNDEASGGGAGGGGVSALFDLPAWQQGLKVARADGTTTPLAKRGVPDV AGDASPQTGYEVSVAGTPAVMGGTSAVAPLWAALIARINAANGASAGWINPVLYKHPGALRDITKGSNGTYAAASGff DACTGLGSPNGAQLATILARKPSS(SEQ ID N0:95)；
[0048]同源物4
[0049] MANHPLNGSERECLKDAQPIGKADPNERLEVTMLVRRRSHDAFEKHISALAAQGASAKHIDHDEFTKHFGADSADLA AVHAFAQKHGLSVVESHEARRAVVLSGT(V/D) AQFDAAFGVSLQQYEHDGGTYRGRTGPIHLPDELNGVVDAVMGLDNRPQARPSFRTRAQGNVRWTARAAGASTFTPV QLASLYDFPQGDGQNQCIGIIELGGGYRPADLKTYFASL匪KAPSVTAVSVDHGRNHPTGDP(N/S/K/G) GPDGEVMLDIEVAGAVAPGAKIVVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)AGFIDAIGTAIHDTKNKPSVISISff(G/S) GPE SAffTQQAMNAFDQAFQSAAALGVTICAASGD(N/S)GS(G/T/A)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGADHV(D/S/H) FPASSPYALGCGGTSLQASGNGIASETVWNDGANGGATGGGVSSFFALPAWQEGLRVTRAGGAHSPLAMRGVPDVAG NADPVTGYEVRVDGHDMVIGGTSAVAPLWAGLIARINAIKGAPVGYINPHLYKDPLALVDITKGNNDDFHATAGWDA CTGLGRPDGKKVKDAVS(SEQ ID NO:75)；
[0050] 同源物5
[0051] MNHDHSPTGGELSNWVRVPGSERAAVQGSRKVGPADPNEQMSVTVVVRRPAADTAVTSMIEKVGAQPLSERRHLTRE EFASTHGANPADLSKVEKFAHEHNLQVKEVNAAAGTMVLSGT(V/D) TSFSKAFGVELSTYEHPDFTYRGRIGHVHIPDYLADTIQSVLGLDNRPQASPRFRVLKEEGGVTTAHAGRTSYTPLE VAALYNFPSIHCKDQCIGILELGGGYRPADLQTYFNGLGIPQPNITDVSVGGAANRPTGDP(N/S/K/G) GPDGEVVLDIEVAAAVTPGAKIAVYFAD(N/D)(S/T)(D/A/T/N)DGFLNAITTAIHDTRNKPSVISISff(G/S) KAEIGffTPQAINAMNQAFRDAAALGVTICCASGD(D/S/N)GS(T/A)(D//N/G)RV(Q/D)DGRYHV(D/S/H) FPASSPYVLACGGTRLESSGSTITQEVVWNEGALGGGATGGGVSDVFDRPNWQANANVPTSANPERRIGRGVPDWAG NADPATGYQILVDGTRAVIGGTSAVAPLFAGLIAIINQKLGHSVGFINPILYNLSAQHNVFHDITSGNNDMSGQNGP YEAQPGffDACTGLGSPDGTKLMNAISEAHRLVSVG(SEQ ID NO:76)；
[0052]同源物6 [0053] MAPEERRTLPGSAMPRPAGAQVLGQIPDDERVEVTVVLQPRAPLPEPGPTPMSRAELADLRSPPEGALEAIARYVAG QGLEVIAADAPRRRIVLAGSAARIAALFGISFVRLQLEGRRYRTYEGEISLPAELAPLVVAVLGLDTRPFARSHRRP AVAPNAPTTAPTVARAYDFPTAYDGRGTTIGFIELGGGFQESDLVRYCEGLGLSTPQVSWGVDGARNAPTCDPNGP DAEVMLDLEVATGVANGADLVLYMAANTDAAFYSAIATALRDATHAPVAISISWGAPEESYPATTIAAFESVLEEAV HVGVTVLVAAGDQGSTDGVDDGRAHVDYPAASPYVLACGGTRLDLDGTTIVAETVWNDLPNGGATGGGISALFPVPS WQAGIAMPPSANPGAGPGRGVPDVAGNADPDTGYRIVVDGVATVVGGTSAVAPLWAGLVARCHQAGARGGFffNPLLY AARGSSAFHEITVGSNGAYDAGPIWNACCGLGSPNGTAILQTLRA(SEQ ID NO:77)；
[0054]同源物6突變株
[0055] MAPEERRTLPGSAMPRPAGAQVLGQIPDDERVEVTVVLQPRAPLPEPGPTPMSRAELADLRSPPEGALEAIARYVAG QGLEVIAADAPRRRIVLAGSAARIAALFGISFVRLQLEGRRYRTYEGEISLPAELAPLVVAVLGLDTRPFARSHRRP AVAPNAPTTAPTVARAYDFPTAYDGRGTTIGFIELGGGFQESDLVRYCEGLGLSTPQVSWGVDGARNAPTCDPNGP DAEVMLDLEVATGVANGADLVLYMAANTDAAFYSAIATALRDATHAPVAISISWSAPEESYPATTIAAFESVLEEAV HVGVTVLVAAGDQGSTGGVDDGRAHVHYPAASPYVLACGGTRLDLDGTTIVAETVWNDLPNGGATGGGISALFPVPS WQAGIAMPPSANPGAGPGRGVPDVAGNADPDTGYRIVVDGVATVVGGTSAVAPLWAGLVARCHQAGARGGFffNPLLY AARGSSAFHEITVGSNGAYDAGPIWNACCGLGSPNGTAILQTLRA(SEQ ID NO:78)；
[0056] 同源物9
[0057] MTKQPVSGSSDKIHPDDAKCI⑶CDPSEQIEVIVMLRRKDEAGFRQMMSRIDAGEAPGQAVSREEFDRRFTASDEDI DKVKAFAKQYGLSVERAETETRSVVLKGT(I/V/D)EQFQKAFDVKLERFQHHNIGEYRGRTGPVNVPDEMHDAVTA VLGLDSKPQARPHFRFRPPFKPLRGAAPASFSPVDLAKLYDFPDGDGAGQCIAIIELGGGYRDSDLSAYFSKLGVKA PTVVPVGVDGGKNAPTGNP(N/S/K/G)GPDGEVTLDIEIAGAIAPGARIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N) AGFVDAVNRALHDAANKPSVISISff(G/S)GPESNWSPQSMSAFNDVLQSAAALGVTVCAASGD(G/S/N)GS(A/ T)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGADHV(D/S/H)FPASSPYVLGCGGTSLAASGAGIAKEVVffNDGDQGGAGGGGVSGTF ALPVWQKGLSVTRNGKHIALAKRGVPDVAGDASPQTGYEVLIDGEDTVVGGTSAVAPLWAALIARINAIDASPAGFV NPKLYKAKTAFRDITEGNNGSFSAAAGffDACTGMGSPDGGKIAAALKPAKPSQSAGQQ(SEQ ID N0:79)；
[0058]同源物IO
[0059