龍虎人丹的中暑模型的構建方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及龍虎人丹的中暑模型的構建方法，具體涉及龍虎人丹在中暑模型及正 常大鼠體內藥代動力學研究。
【背景技術】
[0002] 中暑(heatstroke ,HS)是高溫引起的人體體溫調節功能失調，體內熱量過度積蓄， 從而引發神經器官受損。傳統中藥，特別是中藥復方治療中暑具有悠久歷史，在中暑及并發 癥的防治方面具有獨特的思維和實踐優勢。
[0003] 實驗研究表明：龍虎人丹能降低實驗性中暑大鼠體溫，減輕實驗性中暑大鼠血液 濃縮程度，并有調節實驗性中暑大鼠電解質紊亂現象及降低動物死亡率的作用趨勢，具有 一定的抗中暑作用。關于龍虎人丹在中暑模型動物下的藥代動力學方面的研究還沒有相關 報道，其吸收進入體內的成分不清楚，不利于確定其產生藥效的物質基礎。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于，提供龍虎人丹的中暑模型的構建方法，以克服現有技術所存 在的上述缺點和不足。
[0005] 本研究中采用中暑模型大鼠進行龍虎人丹的藥動學研究，為龍虎人丹的藥效物質 的確定提供幫助;并同時設正常對照組，觀察病理狀態龍虎人丹的藥動學規律的變化。
[0006] 本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：
[0007] 龍虎人丹的中暑模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] 步驟(1)動物的準備:清潔級的大鼠；
[0009] 步驟（1)中，所述大鼠選用Wistar大鼠230 ± 20g，飼養室溫度為23 ± 2°C，濕度為60 ±5%，12h明暗循環，動物適應環境3天后，于實驗前禁食12h，自由飲水。
[0010]步驟(2)中暑模型的建立：
[0011] 大鼠在清潔級動物房內常溫環境下適應性喂養3d后，在人工氣候培養箱內進行熱 暴露。箱內相對濕度55~75%，箱內溫度調節為39°C，大鼠熱暴露Ih;
[0012] 常溫對照組除溫度外，其余環境條件與應激組相同，非熱暴露條件下，大鼠在22~ 25°C室溫條件下飼養，普食，自由飲水，用電子肛溫計測量大鼠肛溫，以肛溫超過40°C±1°C 作為中暑造模成功大鼠；
[0013]步驟(3)給藥與樣品采集：
[0014] 取中暑模型大鼠18只，雄性體重230 ± 20g，隨機分組為中暑高、中、低三個劑量組， 每組6只；并設正常高劑量對照組6只，雄性，禁食12h;
[0015] 步驟(3)中，低劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.115g/kg;中劑量組灌胃給藥龍虎人丹 0.23g/kg;高劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.92g/kg。
[0016] 步驟(3)中，大鼠灌胃給藥后4小時提供食物，整個過程禁食不禁水，于給藥前和給 藥后5111；[11，15111；[11，30111；[11，1]1，2]1，4]1，6]1，12]1，24]1，48]1眼底靜脈叢取血，4°〇6,000\8離心 IOmin得到血漿后，分取上層血漿100μΙ，置于-80°C冰箱中保存，待測。
[0017]步驟⑷樣品測定：
[0018] 血漿按上述建立的LC-MS/MS及HS-SroE-GC-MS/MS方法進行測定，同時進行質量控 制，每個分析批生物樣品測定時建立隨行標準曲線，并進行三濃度雙樣本質控樣品分析，質 控樣品CV〈15%作為當日數據是否接受的標準；
[00?9 ]步驟(5)藥代動力學分析與統計分析：
[0020] 通過每測定批次的隨行標準曲線來計算相應批次中有效成分的血漿藥物濃度，所 得濃度-時間數據。
[0021] 步驟（5 )中，所述數據使用WinNonl in軟件（Bui Id 6 · 1 · 0 · 173，Phars ight Corporation，MO，USA)，采用非房室模型計算Cmax Jm^AUCo-hAUCtH^ti/hCL/FJd/FJRTo-t 藥代動力學參數。
[0022]本發明的有益效果：
[0023] 本發明采用建立的龍虎人丹中8種非揮發性成分液相色譜-質譜分析LC-MS/MS及4 種揮發性成分氣象色譜-質譜分析HS-SPDE-GC-MS/MS生物樣品分析方法，研究了龍虎人丹 在正常及中暑大鼠體內的藥動學研究規律。
[0024] 本發明的結果可為理解龍虎人丹的抗中暑的藥效物質的提供幫助。
【附圖說明】
[0025]圖1正常大鼠口服高劑量(0.92g/kg)(·)、中暑大鼠口服高劑量（)、中劑量(▲) 和低劑量（\)(〇.92,0.23,0.1158/1^)龍虎人丹后兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異甘草苷、甘 草素、異甘草素、胡椒堿和甘草次酸的血藥濃度-時間曲線圖。
[0026]圖2正常大鼠口服高劑量（0.92g/kg)(·)、中暑大鼠口服高劑量（)、中劑量 (▲)、低劑量（X ) (0.92，0.23，0.115g/kg)龍虎人丹后的血藥濃度-時間曲線圖
【具體實施方式】
[0027]以下結合具體實施例，對本發明作進步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發 明而非用于限定本發明的范圍。
[0028] 實施例1
[0029] 1.材料與方法
[0030] 1.1.動物
[0031]清潔級Wistar大鼠（230 ± 20g)由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。飼養室溫度 為23 ± 2°C，濕度為60 ± 5 %，12h明暗循環，動物適應環境3天后，于實驗前禁食12h，自由飲 水。
[0032] 1.2.中暑模型的建立
[0033]大鼠在清潔級動物房內常溫環境下適應性喂養3d后，在人工氣候培養箱內進行熱 暴露。箱內相對濕度55~75 %，箱內溫度調節為39°C，大鼠熱暴露Ih。常溫對照組除溫度外， 其余環境條件與應激組相同，非熱暴露條件下，大鼠在22~25°C室溫條件下飼養，普食，自 由飲水。用電子肛溫計測量大鼠肛溫，以肛溫超過40°C±1°C作為中暑造模成功大鼠。
[0034] 1.3.給藥與樣品采集
[0035] 取中暑模型大鼠18只，雄性(體重230±20g)，隨機分組為中暑高、中、低三個劑量 組，每組6只；并設正常高劑量對照組6只，雄性，禁食12h。低劑量組灌胃給藥龍虎人丹 0.115g/kg;中劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.23g/kg;高劑量組灌胃給藥龍虎人丹0.92g/kg。 灌胃給藥后4小時提供食物，整個過程禁食不禁水。于給藥前和給藥后5min，15min，30min， 111，211，411，611，1211，2411，4811眼底靜脈叢取血，4°〇6,000\8離心101^11得到血漿后，分取上層 血漿1〇〇μ1，置于_80°C冰箱中保存，待測。
[0036] 1.4.樣品測定
[0037] 血漿按上述建立的LC-MS/MS及HS-SroE-GC-MS/MS方法進行測定。同時進行質量控 制，每個分析批生物樣品測定時建立隨行標準曲線，并進行三濃度雙樣本質控樣品分析，質 控樣品CV〈15%作為當日數據是否接受的標準。
[0038] 1 · 5 ·藥代動力學分析與統計分析
[0039] 通過每測定批次的隨行標準曲線來計算相應批次中有效成分的血漿藥物濃度，所 得濃度_時間數據使用WinNonl in軟件（Bui Id 6 · 1 · 0 · 173，Pharsight Corporation，M0， 1^)，采用非房室模型計算(^、1^^1]0)-*^1]0)-〇〇、切2、〇^、￥(1/^、]\?1'()-*等藥代動力學參 數。
[0040] 2.結果
[0041 ] 2.1LC-MS/MS 部分
[0042]中暑模型大鼠和正常大鼠灌服龍虎人丹后血漿濃度-時間曲線見圖1，各成分的藥 動學參數見表1-表SASahHSmhHSm)分別為中暑低劑量組，中暑中劑量組和中暑高劑 量組。
[0043]結果表明，兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、胡椒堿和甘草 次酸等成分吸收進入血中，其中甘草次酸濃度最高。甘草次酸和胡椒堿在模型3個劑量組和 正常組、甘草素和異甘草素在模型高及中劑量組和正常組、而兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異 甘草苷僅在模型高劑量組和正常組可以繪制出C-T曲線。
[0044]兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異甘草苷和胡椒堿吸收快，在Ih內達峰，消除快，t1/22h 左右;甘草素、異甘草素吸收也快，在IOmin左右達峰，但在2h左右出現第2峰，具有雙峰現 象，消除略慢，t1/22.6-6h左右;甘草次酸達峰較遲，可能與其需腸菌轉化而來有關，消除在 所有成分中最慢，t 1/26h左右。
[0045]本實驗結果也表明，龍虎人丹中的異甘草苷和胡椒堿在中暑大鼠體內的暴露量增 加，tl/2延長。
[0046]圖1正常大鼠口服高劑量(0.92g/kg)(·)、中暑大鼠口服高劑量（)、中劑量(▲) 和低劑量（\)(〇.92,0.23,0.1158/1^)龍虎人丹后兒茶素、表兒茶素、甘草苷、異