一種樹鼩單純皰疹病毒性角膜炎hsk模型的構建、評估方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型的構建、評估方法及其應用，屬于人類疾病動物模型技術領域。
技術背景
[0002]單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是自然界廣泛存在易感染人類的傳染性病毒，超過80 %的全球人口感染過單純皰疹病毒，單純皰疹病毒分為兩種基因型，即I型和II型單純皰疹病毒。I型單純皰疹病毒(HSV-1)感染部位是頭頸部，可引起多種人類疾病，包括口唇皰疹，齦口炎，角膜炎，甚至引起腦炎。Π型的感染部位是生殖器，偶或也引起眼部感染。Π型感染新生兒，除累及眼部還可波及皮膚、血液、內臟和中樞神經系統，并可致命。人是HSV唯一的自然宿主，大多數人在幼兒時期就被HSV感染，在此之后，病毒終身潛伏在三叉神經節(trigeminal gangl1n,TG)的感覺神經元內。
[0003]單純皰疹病毒感染引起的角膜炎癥稱為單純皰疹病毒性角膜炎(Herpessimplexkeratitis，HSK)，眼部HSV感染主要由HSV-1引起。HSV-1角膜炎是常見、且嚴重的角膜病，也是當今危害嚴重的感染性眼病之一。它是由病毒感染、免疫與炎癥反應參與、損傷角膜及眼表組織結構的復雜性眼病，感染HSV-1后，多數人沒有明顯癥狀，少數發展成有危害的皰疹病毒性角膜炎。復發的角膜感染引起眼睛發病，導致不可逆的角膜瘢痕形成，變薄，新生血管生成，最終失明，其復發的詳細機制尚不清楚。
[0004]HSV-1感染眼睛及相關的后遺癥是傳染性角膜發病和致盲的主要原因，皰疹病毒的感染情況，可追溯到幾千年前，至今人類仍然飽受這種病毒的折磨。盡管已經進行了四十多年的HSK研究，主要的治療方法仍舊是局部療法，現在更多是全身性的阿昔洛韋給藥，聯合局部的皮質激素治療。即使進行角膜移植術治療后，病人仍然大部分復發HSK，且診斷出這些病人有HSV再激活現象，因此，皰疹病毒性角膜炎易復發，很難根治，迫切需要建立合適的動物模型，研究其病毒潛伏及再激活機制，為皰疹病毒性角膜炎的治療以及藥物篩選提供基礎依據。
[0005]目前，小鼠和家兔等嚙齒類是主要的用于皰疹病毒性角膜炎研究的模型動物，但由于小鼠的角膜很小，很難進行手術操作，感染后可取材的標本少，而且不利于病毒感染大體形態學的觀察。此外，小鼠模型缺乏對病毒的臨床再激活能力。家兔模型與人類感染的免疫反應差異大，且家兔實驗成本高。因此，迫切需要建立一個更接近于人的靈長類動物模型，來模擬人類單純皰疹病毒性角膜炎的發生、發展過程，為皰疹病毒性角膜炎的治療提供理想的動物模型。
[000?] 樹駆](Tupaia belangeri)在分類學上屬哺乳綱，有胎盤類，是一個獨立的目，稱為攀駒目(Scandentia)，介于靈長目與食蟲目之間。樹駒具有體型小，易飼養和操作，管理方便，廉價經濟，且其進化程度高，新陳代謝和大體解剖比犬、大小鼠等動物與人更為接近，解剖結構也更近似于人，特別是樹駒角膜結構和人角膜非常類似。為此，我們擬通過建立樹駒HSV-1角膜炎模型來模擬人類單純皰疹病毒性角膜炎的感染，研究調控病毒潛伏的機制及病毒性角膜炎臨床治療研究;通過非人靈長類模型獲得的基礎數據更有助于臨床治療的篩藥研究，將會帶來很大的社會和商業效益。
【發明內容】
[0007]鑒于現在對HSV角膜炎實驗動物模型開發的需求，本發明擬設計一種樹駒HSV角膜炎模型的建立及評估方法，通過HSV-1病毒經眼睛接種感染樹駒，建立樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型，為研究皰疹類病毒性角膜炎的感染機制，致病機理及藥物治療研究提供更好的實驗動物模型。
[0008]本發明的技術方案:一種樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型的構建方法是將HSV-1病毒經樹駒眼睛接種感染HSV-1病毒，建立樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型，包括以下步驟:
[0009](I)實驗動物準備:準備6月-3歲齡雌性成年健康樹駒；
[0010](2)樹駒的麻醉及處理:用氯胺酮麻醉動物，將樹駒固定于專用的小布袋中，稱量并記錄其體重，在樹駒大腿內側肌肉豐厚處注射鹽酸氯胺酮，5分鐘后，樹駒處于麻醉狀態；
[0011](3)病毒感染:將HSV-1病毒滴加到樹駒兩只眼膜上，即可得到樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型。
[0012]其中，步驟(3)中所述的HSV病毒為野生型HSV-1 17+或HSV-1 McKrae毒株。
[00?3] 進一步地，步驟(2)中所述的氯胺酮(ketamine)的用量為按樹駆]體重為50mg/kg?100mg/kgo
[0014]進一步地，步驟(3)中當采用HSV-117+病毒時，需要以Iml注射器針頭劃痕動物眼膜，即建立表面劃痕，橫豎各劃痕十次，然后將HSV-1 17+病毒滴加到樹駒眼膜。
[0015]進一步地，步驟⑶中采用的病毒感染劑量為I X 14PFU/眼睛?I X 16PFU/眼睛。
[0016]本發明提供了一種評估樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型的方法，取材病毒感染樹鼠句的眼睛，利用裂隙燈檢查、PCR(Polymerase Chain React1n) nqRT-PCR(quantitativereal-time polymerase chain react1n)、免疫組化、原位雜交、體外共培養實驗、組織活病毒檢測及病毒基因組定量等方法，對樹駒眼睛組織的感染、病毒潛伏及重激活進行研究，鑒定及評估樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型。
[0017]利用本發明方法構建的樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型在單純皰疹病毒性角膜炎等發病機制機理研究和治療、以及藥物評價方面的應用。
[0018]HSV-1感染樹駒后，在急性感染期，樹駒出現與人類皰疹病毒性角膜炎(HerpesSimplex Keratitis，HSK)癥狀相似的眼部疾病。急性感染期的樹駒角膜中可檢測到活病毒和病毒蛋白；潛伏期樣本中，樹駒眼睛視神經節中可檢測到潛伏相關轉錄子LAT的表達;角膜和視神經節的組織勻漿上清中均可檢測到活病毒，證明潛伏感染的樹駒具有病毒自發重激活現象。因此，樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型的建立，可更好地模擬人類皰疹病毒性角膜炎的感染，對其感染機制及抗病毒類藥物開發的應用研究都具有很大的價值和潛力。
[0019]本發明的有益效果:I)選用更接近于人類或靈長類的樹駒，首次成功建立樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型，能更好地模擬人類的HSV-1角膜炎感染，可為HSV-1角膜炎感染機制及抗病毒藥物治療研究提供更好的實驗動物模型;2)用本發明的方法構建出樹駒單純皰疹病毒性角膜炎模型的病變特點與人類皰疹病毒性角膜炎感染的臨床癥狀相似，模型重復性、穩定性好，適用于各種治療性研究和相關的基礎性研究，為進一步研究皰疹病毒性角膜炎的致病機制、發病機理及抗病毒藥物篩選等方面的研究奠定了基礎;3)該構建方法操作簡單，技術、設備要求低，成功率高。
【附圖說明】
[0020]圖1為裂隙燈檢查樹駒皰疹病毒性角膜炎(HSV-1McKrae感染)，其中圖1A為樹駒對照組角膜檢測圖，圖1B、圖1C、圖1D、圖1E、圖1F分別為樹駒感染5天、8天、12天、19天、33天裂隙燈檢查樹駒皰疹病毒性角膜炎情況圖，每幅圖上圖是裂隙燈明場下拍照，下圖是裂隙燈紫外燈下拍照(熒光素染色顯示角膜炎性細胞)；
[0021]圖2為裂隙燈檢查樹駒皰疹病毒性角膜炎(HSV-117+劃痕感染)，其中圖2A為樹駒劃痕5天對照組，圖2B、圖2C、圖2D、圖2E、分別為樹駒感染5天、15天、30天、50天裂隙燈檢查樹駒皰疹病毒性角膜炎情況圖，圖2F為樹駒劃痕50天對照組；
[0022]圖3為HE染色觀察樹駒角膜的病變圖，其中，圖3A為樹駒對照組，圖3B、圖3C、圖3D、圖3E、圖3F、圖3G、圖3H、圖31分別為HSV-1感染樹駒后第5天、8天、10天、13天、20、33天、46天、54天HE染色觀察樹駒角膜的病變圖；
[0023]圖4為免疫組化檢測樹駒角膜中的HSV-1病毒蛋白變化比較圖，其中，圖4A為未感染的樹駒對照組，圖4B、圖4C、圖4D、圖4E、圖4F、圖4G、4H、4I分別為HSV-1感染的樹駒眼睛在感染后第5天、8天、10天、13天、20天33天、46天、54天樹駒角膜中均