轉錄譜印記預測藥物ms-275在制備小鼠炎癥性腸病藥物中的應用
【技術領域】
[00011本發明涉及轉錄譜印記預測藥物MS-275在制備小鼠炎癥性腸病藥物中的應用
【背景技術】
[0002] 炎癥性腸病（Inflammatore Bowel Disease, IBD)是一組病因尚不十分清楚的慢 性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。IBD是北美及歐洲的常見病。 近年來隨著生存環境及膳食結構的改變，我國IBD發病率呈明顯增加趨勢，構成日益嚴重的 社會健康問題。深入揭示IBD發生發展的分子機制，并發掘潛在的干預治療靶點，對提高IBD 防治水平有重要意義。
[0003] IBD發病機制尚未完全明確，目前主要認為與遺傳、環境、免疫等因素有關。目前仍 缺乏安全有效的藥物誘導及維持緩解。藥物臨床上多用氨基水楊酸制劑(5-ASA)，糖皮質激 素，免疫抑制劑、生物制劑等藥物緩解治療IBD;激素類藥物作用雖明確，卻難于獲得滿意療 效，新的生物制劑僅對部分患者有效。因此，開發新型靶向藥物對改善IBD患者預后，干預并 阻斷疾病向腸癌轉變，對提高人民健康水平具有深遠意義。
[0004] 轉錄譜印記（gene-expression signatures)比對方法是運用一定數量顯著差異 表達基因的有序集合代替原始轉錄譜，通過將細胞或組織在生理、病理、藥物治療等狀態下 的轉錄譜，與數據庫中的各種基因沉默、miRNA干擾和相關疾病的表達譜進行比對和相關性 計算分析，挖掘出與疾病及藥物治療相關的基因干擾印記。項目申請者前期運用GEO等轉錄 譜數據庫中數據建立了 IBD和13 10種藥物作用構成的轉錄譜印記關聯網絡，通過 AfTymetrix基因芯片數據與上述轉錄譜印記數據庫進行比對，得出一系列疾病-藥物距離 值，發現一些新型可能為治療IBD潛力藥物，排名前三分別是MS-275、三氟拉嗪和皮質酮(距 離值分別是-〇 · 20166，-0 · 1795，-0 · 17228，負值越大越有可能起治療作用；其中強的松，一 種有效治療IBD急性發作糖皮質激素，距離值為-0.07073)。申請者運用MS-275干預DSS誘導 的小鼠急性IBD模型，發現與激素治療組、模型對照組相比，在小鼠急性發病期間，MS-275疾 病活動指數(DAI)評分明顯低于其他非空白對照組，結腸炎組織病理評分明顯低于其他處 理組。以上轉錄譜印記計算結果及模型動物驗證提示:MS-275極可能是有效治療及誘導IBD 緩解新型藥物。
[0005] 基因表達的精確調控是細胞正常增殖分化及機體生長發育的基礎;組蛋白乙酰化 轉移酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)分別通過乙酰化及去乙酰化組蛋白或非組蛋白 來協同調節DNA的表達及蛋白的活性狀態，隸屬表觀遺傳學的范疇。當HDAC過度表達引起轉 錄因子募集時，就會引起相關蛋白表達受到抑制，從而導致機體處于疾病狀態。組蛋白去乙 酰酶抑制劑(Histone deacetyIase inhibitor,HDACi)因能有效誘導基因表達、促進細胞 分化、致使腫瘤細胞凋亡及產生細胞周期阻滯的抗腫瘤活性，從而在治療血液惡性腫瘤上 得到應用。近年HDACi類藥物作為潛在抗炎藥物為治療IBD提供了新的思路。
[0006] MS-275(又名SNDX-275 ,Entinostat，恩提諾特）隸屬合成型酰胺類HDACi，是高度 特異的組氨酸乙酰基轉移酶抑制劑，選擇性親和I型HDAC(包括HDAC1/3KMS-275抑制HDAC 效力雖不及TSA等一些其他HDACi，但其在體內抗腫瘤效果顯著(經過I/II期臨床試驗），具 有藥毒性小，口服有效，有高度的選擇性與特異性等優點。MS-275作為特異性高HDAC1/3抑 制劑，在治療IBD尚無報道。在免疫調節方面，MS-275通過抑制HDAC3活性影響調節性T淋巴 細胞(Tregs)生成及Foxp3+的表達;此外，HDAC3可影響黏附因子、干擾素、MHCn類分子以及 轉錄因子如STAT1、STAT3和NF-κΒ相關基因表達，抑制HDAC3可減少TNF-a，IL-l/6等下游促 炎癥因子的產生，減輕炎癥程度。由此，MS-275作為一種特異性強的HDAC1/3抑制劑在治療 緩解免疫相關疾病IBD中具有巨大藥物潛力。本發明旨在通過動物實驗揭示轉錄譜預測藥 物MS-275在預防和治療DSS所誘導的小鼠急性IBD模型中的重要作用，并探討其內在機制， 并為其在臨床上運用提供重要的思路。
【發明內容】
[0007]本發明目的是針對目前治療IBD藥物的缺陷，提供一種轉錄譜印記預測藥物MS-275 在制備小鼠炎癥性腸病藥物中的應用。
[0008]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種轉錄譜印記預測藥物MS-275在 制備小鼠炎癥性腸病藥物中的應用。
[0009] 進一步地，該應用具體為，將預測藥物MS-275與二甲亞砜(DMSO)和生理鹽水按照 質量比1:22:500混合均勻后，調節PH至5.0-7.0。
[0010] 本發明的有益效果是，本發明基于轉錄譜預測藥物MS-275能靶向抑制TNF-a，IL-6 產生，有效改善小鼠結腸炎癥程度的特點，將其應用于制備小鼠炎癥性腸病藥物，具有藥毒 性小，高度的選擇性與特異性等特點。
【附圖說明】
[0011] 圖1為DSS誘導的小鼠急性IBD模型結果圖；A:模型組及對照組小鼠期間每天的結 腸炎疾病活動指數(DAI) ;B:模型組及對照組小鼠結腸長度;C:模型組及對照組小鼠遠端結 腸促炎癥因子TNF-a、IL-6、IFN- γ含量;D:兩組小鼠結腸組織H&E染色;E:模型組及對照組 小鼠結腸炎病理評分。
[0012] 圖2為MS-275減輕IBD模型小鼠 DAI結果圖；
[0013]圖3為IBD小鼠模型陰性對照組、模型對照組、激素對照組及MS-275對照組的存活 率(圖3A)及結腸長度（圖3B)比較結果圖；
[0014]圖4為IBD小鼠模型陰性對照組、模型對照組、激素對照組及MS-275對照組的病理 結果圖；
[0015]圖5為MS-275降低小鼠結腸炎組織病理評分結果圖；
[0016] 圖6為MS-275逆轉LPS所致小鼠巨噬細胞產生炎癥因子TNF-a、IL-6升高結果圖。
【具體實施方式】 [0017] 實施例！
[0018] (一)材料與方法
[0019] 1、主要儀器：
[0020] 7900 Real Time PCR System(美國Applied Biosystems公司）；C02細胞培養箱 MODEL 3111 (美國ThermoScientif ic公司）；六孔培養板(美國Corning公司）。
[0021] 2.藥品和試劑
[0022] 胎牛血清(FBS)、DMEM培養液(澳洲GIBCO公司），甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿（國藥集 團化學試劑有限公司），小鼠 TNF-a、IL-6ELISA試劑盒(美國eBioscience有限公司），Trizol 試劑、RT-qPCR試劑盒（日本Takara公司）；PCR引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公 司）；脂多糖(LPS，美國Sigma公司）。
[0023](二)細胞實驗及處理方案
[0024] 用含10%FBS的DMEM培養基培養小鼠巨噬細胞RAW264.7。分為4組：陰性對照組(NC 組），藥物對照組(MS-275處理組），單純刺激組(LPS處理組)及MS-275治療組(LPS+MS-275)。 具體方案為：用2μΜ MS-275預處理RAW264.7細胞1小時，后用lμg/ml LPS刺激該細胞6小時， 提取細胞mRNA及留取細胞培養上清。運用qPCR測定細胞內促炎癥因子TNF-α及IL_6mRNA表 達水平。ELISA法測定培養上清中相應TNF-a及IL-6蛋白表達量。
[0025](三）RT-qPCR
[0026] 按照Trizol試劑的說明書提取得到小鼠巨噬細胞總RNA，按照RT試劑盒說明書逆 轉錄得到cDNA，按照qPCR試劑盒說明書檢測特定基因的mRNA表達量。實驗涉及的引物序列 如表3所述。
[0027] 表3.引物序列
[0029]~(四)數據統計
[0030] 各組實驗數據均以mean土S.E.M.表示，采用GraphPad Prism 5軟件進行統計分 析，采用unpaired Student's t test進行兩組間