一種包載核酸藥物的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種包載核酸藥物的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體，屬于藥 物制劑學領域。
【背景技術】
[0002] 脂質體（liposomes)是一種由排列有序的脂質雙分子層組成的單層或多層微囊。 脂質體屬于膠體系統，具有類似細胞的結構，與細胞膜親和力強，可W增加被包封藥物透過 細胞膜的能力。脂質體生物相容性好，可實現藥物體內祀向遞送，具有延長藥物作用時間、 增加藥物的體內外穩定性、降低藥物毒性，增強藥理作用等諸多優點。
[0003] 目前關于脂質體的研究較多，并已取得許多進展。作為核酸類藥物載體的脂質體， 多數為陽離子脂質體，該脂質體的正電荷表面雖然利于攜帶核酸類藥物，但是卻不利于載 體的體內循環，同時，陽離子濃度越高其毒副作用越大，限制了其體內使用的劑量，因此目 前所研究的陽離子脂質體遞送核酸藥物仍不能滿足臨床需求。
【發明內容】
[0004] 為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種包載核酸藥物的具缺氧響應能 力和放療增敏功能脂質體;該脂質體的親水頭部為可質子化的叔胺基團或憐酸基團，若為 憐酸基團需通過輔助脂質分子引入叔胺基團，使其在正常生理抑(7.35~7.45)條件下呈電 中性，利于體內長循環，而在腫瘤微酸的環境下，可發生質子化，利于脂質體進入腫瘤細胞； 該脂質體的疏水末端連接有缺氧響應的硝基咪挫基團，其在缺氧的環境下疏水的硝基轉變 為親水的氨基，破壞了脂質體的穩定性的同時加大了脂質體的電荷，利于脂質體從內涵中 逃逸出來，提高核酸類藥物的療效；同時引入的硝基咪挫基團在缺氧條件下具有放療增敏 的作用，提高放射治療抑制腫瘤生長的作用。
[000引經過多次試驗，為提高載藥脂質體制備效率，本發明采用了 W下的技術方案： 一種包載核酸藥物的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體，它包括脂質體和核酸藥 物;所述的脂質體中各原料及其質量百分比為:具放療增敏功能的脂質分子20~80%;膽固醇 5~50%;聚乙二醇憐脂3~50%; DOPC脂質分子^300/0; 所述的脂質體與核酸藥物中核酸的N/P為1: (1~20); 所述的具放療增敏功能的脂質分子，具有如下結構通式：
其中： n為10-26之間的任意數;n進一步優化為10-18之間任意數； 基團X為：
所述的基團X中：X1為
，亞甲基或不存在； X2為亞甲基或1,2-亞乙基；
當Xl為 ，X3，X4和X5均為甲基； 當Xl為 時，X3和X4為氨，甲基，乙基或異下基;X5不存在； 基團R為:
所述的基團R中：Rl為氨或甲基，其甲基上還可連一面素氯； R2為亞甲基或1,2-亞乙基； 當R3為硝基時;R4為氨，甲基或無基團； 當R4為硝基時;R3為氨或甲基。
[0006] 所述的具放療增敏功能的脂質分子，其結構式為：
[0007] 所述的聚乙二醇憐脂為 DSPE-PEGlOOOtDSPE-PEGSOOChDSPE-PEGSAOChDSPE-reGSOOO。
[000引所述核酸藥物為RNA，DNA，反義核酸，質粒，干擾核酸，適體，antagomir，miRNA，核 酶及S iRNA中的一種或兩種W上的混合物。
[0009] 所述核酸藥物為具有腫瘤增殖抑制作用的SiPLKl，具有放療增敏作用的化ait。
[0010] 所述的一種包載核酸藥物的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體的制備方法， 按如下方法制備： 按配比稱量原料具放療增敏功能的脂質分子，膽固醇，聚乙二醇憐脂和DOPC脂質分子， 并溶解于有機溶劑中，通過乙醇注入法或油膜法，制成脂質體； 將脂質體邊攬拌邊加入到抑=2~5的巧樣酸緩沖溶液，脂質體在巧樣酸中的濃度為0.5~ 10 mg/mL，再向巧樣酸緩沖溶液中加入稱量好的核酸藥物，在37~70°C的溫度下水浴加熱， 水浴加熱2~IOmin，制得包載核酸藥物的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體。
[0011] 所述的有機溶劑為分析純乙醇。
[0012] 所述的包載核酸藥物的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體的粒徑為納米級 或微米級。
[0013] 所述的一種包載核酸藥物的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體應用于治療 由基因異常表達引起的相關疾病藥物中；所述疾病包括遺傳病，例如血友病、囊性纖維病和 家庭型高膽固醇血癥;惡性腫瘤，例如腦膠質瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、結腸癌、食管 癌、胃癌、大腸癌、鼻咽癌、宮頸癌、血癌和骨癌。
[0014] 本發明的有益效果： 1、 本發明的脂質體的親水頭部為可質子化的叔胺基團，該脂質體在正常生理pH 口.35~ 7.45)條件下呈電中性，利于體內長循環，而在腫瘤微酸的環境下，可發生質子化，利于脂質 體進入腫瘤細胞； 2、 本發明的脂質體的疏水末端連接有缺氧響應的硝基咪挫基團，其在缺氧的環境下疏 水的硝基轉變為親水的氨基，破壞了脂質體的穩定性的同時加大了脂質體的電荷，利于脂 質體從內涵中逃逸出來，提高核酸類藥物的療效； 3、 本發明的脂質體由于硝基咪挫基團的引入，使其在缺氧條件下具有放療增敏的作 用，提高放射治療抑制腫瘤生長的作用。
[0015] 4、本發明包含的輔助脂PEG可W有效延長脂質體在體內的有效循環時間，從而延 長藥物作用時間;膽固醇具有膜穩定性，增強了脂質體的體內循環穩定性。
[0016] 5、本發明質子化脂質體，穩定性高，適用劑型廣泛，可W進一步加工，形成口服、黏 膜、注射、皮膚給藥制劑的原料，制成發揮預防、治療、保健、清潔、美容作用的具體制劑。
[0017] 6、本發明采用乙醇滴入法，方法簡便，操作簡單，而且效率高，易于普及。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明實施例1所制備包載核酸類藥物SiPLKl的脂質體的電鏡形貌表征； 圖2為本發明實施例1所制備包載核酸類藥物SiPLKl的脂質體的粒徑表征； 圖3為本發明實施例1所制備包載核酸類藥物SiPLKl的脂質體的表面電位表征； 圖4為本發明實施例1所制備包載核酸類藥物SiPLKl的脂質體的瓊脂糖凝膠電泳結果； 圖5為本發明實施例1所制備包載核酸類藥物SiPLKl的脂質體的CCK8細胞毒性實驗結 果； 圖6為本發明實施例1所制備包載核酸類藥物SiPLKl的脂質體的q-PCR結果； 圖7為本發明實施例1所制備包載核酸類藥物SiPLKl的脂質體的WB結果； 圖8為本發明實施例9所制備包載核酸類藥物化ait的脂質體的瓊脂糖凝膠電泳結果； 圖9本發明實施例9所制備包載核酸類藥物化ait的脂質體的電鏡形貌表征； 圖10為本發明實施例9所制備包載酸類藥物化ait的脂質體的細胞集落實驗結果。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明作進一步說明。
[0020] 實施例1 具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體的制備 所選用核酸藥物SiPLKl為特殊降解PLKl; Si化Kl序列為:AGATCACTCTCCTCAACTATT;(核酸藥物文獻來源：InMbition Of 化Io-Iike kinase 1 reduces beta-amyloid-induced neuronal cell death in Alzheimer's disease. Bing Song, Korbin Davis, X. Shawn Liu, Hyoung-gon Lee, Mark Smith, and Xiaoqi Liu. AGING. 2011, 3: 846-851)〇
[0021] 所選用具放療增敏功能的脂質分子為：
將具放療增敏功能的脂質分子，膽固醇，聚乙二醇憐脂和DOPC脂質分子各組分，分別溶 解于乙醇溶劑中，使其各組分濃度為20 yg/yL，搖勻，溶解過夜備用;抽取各組分脂質體，具 放療增敏功能的脂質分子（100 yL= 2000 yg)，膽固醇（20 yL= 400 yg)，聚乙二醇憐脂 DS陽-PEG2000(18 yL=360 yg)和DOPC脂質分子(9化=180 yg);充分混勻，并將混合液轉移 到一次性1 mL醫用注射器中，將注射器中的混合液，在37°C條件下，緩慢(0.5~2滴/秒)滴入 巧樣酸緩沖液中，邊滴邊用磁力攬拌器混勻，脂質體在巧樣酸中的濃度為3 mg/mL之后取 出一定量脂質體溶液，根據不同N/P加入核酸藥物SiPLKl(例如N/P為5時，22.5 yg脂質體加 入1 yg SiPLKl，依此類推），在60°C的溫度下水浴加熱，水浴加熱5 min,制得包載核酸藥物 SiPLKl的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體。
[0022] 實施例2 具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體形貌的表征 用透射電鏡檢測具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體的形貌，將實施例1制得包載 核酸藥物SiPLKl的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體沾到銅網上，用濾紙吸掉多余液 體，驚干銅網上的液體后，用透射電鏡進行拍攝。結果顯示，合成的脂質體是具有明顯的雙 分子層結構，粒徑在100 nm左右，見圖1。
[0023] 實施例3 粒度儀下質子化脂質體的粒徑 將實施例1制得包載核酸藥物SiPLKl的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體(3 mg/ mL)加入馬爾文粒度檢測儀專用比色皿中，打開檢測程序進行粒徑檢測，檢測結果顯示，所 合成的脂質體水力學直徑130 nm左右，見圖2。
[0024] 實施例4 粒度儀下質子化脂質體的電位 將實施例1制得包載核酸藥物SiPLKl的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體加入馬 爾文粒度檢測儀專用帶電極比色皿中，打開檢測程序進行粒徑檢測，所檢測的脂質體濃度 為3 mg/mL，并經過PBS透析，檢測結果顯示，所合成的脂質體電位呈電中性，見圖3。
[002引 實施例5 具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體核酸類藥物制劑的基因復合能力的研究 具有強的基因復合能力是核酸類藥物制劑成功的關鍵因素，本實施例采用凝膠滲透電 泳實驗考察本發明所述的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體核酸類藥物制劑的基因 復合能力。
[0026] 稱取0.8 g的瓊脂糖溶于40 ml IXTAE溶液中，在微波爐中加熱使瓊脂糖顆粒完 全溶解，冷卻，加入5 iiL的核酸染料漠化乙錠于冷卻的瓊脂糖凝膠中，凝膠加入凝膠槽，自 然凝固。將不同N/P的具缺氧響應能力和放療增敏功能脂質體/siRNA復合物(例如N/P為5 時，22.5 yg脂質體加入Iyg SiPLKl，依此類推）（實施例1所述)與2化的Loading Buffer的 混合液加入到瓊脂糖凝膠孔內，設置電泳電壓為110 V進行電泳實驗，常溫下電泳10 min， 實驗結果表明，本發明實施例1制得包載核酸藥物Si化Kl的具缺氧響應能力和放療增敏